CM-H2DCFDA 活性氧（ROS）熒光探針

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

CM-H₂DCFDA，英文全名：5-(and 6-)chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester，中文全名：5-(and 6-)氯甲基-2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯，是一種通用的氧化應激指示劑，是H₂DCFDA（DCFH-DA，貨號：NBS6702）的氯甲基衍生物，在活細胞中表現出更好的滯留率。CM-H₂DCFDA具細胞膜滲透性，主動(dòng)擴散進(jìn)入胞內，其乙酸酯基團被細胞內酯酶切割，其硫醇反應性的氯甲基基團與細胞內谷胱甘肽和其他硫醇發(fā)生反應。后續氧化產(chǎn)生熒光加合物被捕獲在細胞內，從而有助于長(cháng)期研究。通過(guò)流式細胞儀、熒光計、熒光酶標板或熒光顯微鏡（配有適用于熒光素的激發(fā)光源和濾光片）對熒光信號進(jìn)行監測。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無(wú)水DMSO配制成1-10mM儲存液，常用工作濃度1-10μM，需根據自身的實(shí)驗體系或參考文獻進(jìn)行優(yōu)化。

產(chǎn)品特性：

1） 同義名：5-(and 6-)chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester; 5-(and 6-)氯甲基-2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯；

2） 分子式：C₂₇H₁₉Cl₃O₈

3） 分子量：577.8

4） 純度：≥90%

5） 外觀(guān)：粉末

6） 激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)：~492–495/517–527 nm

7） 溶解性：溶于DMSO、DMF、無(wú)水乙醇

8）化學(xué)結構圖：

保存條件: 

-20oC避光干燥保存，至少1年有效。 

產(chǎn)品使用：（僅作參考）

以下步驟是來(lái)源于大量文獻總結的簡(jiǎn)易操作流程，僅作參考。用戶(hù)需根據特定的應用和敏感性來(lái)做調整。

1） 將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無(wú)水DMSO或其他有機溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光凍存在≤-20℃，避免反復凍融。

2） 于正式實(shí)驗前，用生理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到工作濃度1-10μM。需根據具體應用來(lái)調整合適的工作濃度。

3） 吸走培養液，加入步驟2）配制的染色工作液到細胞內，室溫或30℃孵育5~60min。

4） 吸走染色工作液，用預熱的生理緩沖液或細胞培養液清洗一遍。重新加入預熱的生理緩沖液或細胞培養液，在適宜溫度內孵育。對于二乙酸酯衍生物，需要短暫復原時(shí)間讓細胞內酯酶將其水解，從而讓染料對氧化應激產(chǎn)生反應。最佳的復原時(shí)間范圍很廣，由于某些細胞類(lèi)型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

5） 將細胞暴露于實(shí)驗刺激物之前，先測定加載細胞的背景熒光強度。

6） 根據以下情況評估陰性對照（Negative control），

6.1 綠色發(fā)射光譜內檢查未染色細胞的自熒光情況。

6.2 對于流式分析，查明染料加載和處理后細胞的前向角散射和側向角散射是不變。細胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應引起的。

6.3 對包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養基的無(wú)細胞混合物進(jìn)行熒光檢測。在不含細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著(zhù)時(shí)間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導氧化有關(guān)。

6.4 檢查培養在生長(cháng)培養液或簡(jiǎn)單緩沖液內的未處理加載細胞（對照）的熒光。在健康細胞內，細胞內酶和/或天然抗氧化劑會(huì )清除這些氧自由基。經(jīng)過(guò)染料加載復原時(shí)間后，健康細胞應該表現出低水平的熒光信號，且在整個(gè)實(shí)驗期間相對穩定。然而，逐漸增加（由于自氧化）或降低（由于細胞內染料喪失或光淬滅）也有可能觀(guān)察到。在不含任何刺激物或誘導劑的體系內，健康和未處理細胞突然發(fā)現強熒光，表明細胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

7） 建立陽(yáng)性對照（Positive control），可能用以下方法刺激氧化活性：

① 腫瘤促進(jìn)劑（PMA，工作濃度100pM~10μM）

② 細菌趨化肽（fMLP，工作濃度1~10μM）

    ③ H₂O₂或TBHP（終濃度~100μM）（根據細胞本身對其的靈敏度和反應性來(lái)提高或降低濃度）

8） 確保刺激藥物或化合物不會(huì )引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會(huì )與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。

注意事項：

1.      有機溶劑如DMSO儲存液需分裝成單次用量后，-20oC避光保存，避免反復凍融。

2.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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