Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

研究意義：

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，參與細胞生長(cháng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。

產(chǎn)品描述：

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，或ROS Assay Kit）是一種利用熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）進(jìn)行細胞內活性氧水平檢測的常用方法。檢測原理在于DCFH-DA本身無(wú)熒光，能自由穿過(guò)細胞膜，一旦進(jìn)入細胞后，被胞內的酯酶水解生成無(wú)熒光的DCFH。DCFH不能穿透細胞膜，從而保留在胞內。此時(shí)胞內的活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF。通過(guò)DCF熒光的強弱即可反映活性氧的水平。

本試劑盒包含活性氧陽(yáng)性對照Rosup，利于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/ml。因檢測對象和反應體系的不同，本試劑盒可檢測100-500個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

保存與運輸方法：

保存：-20oC保存，有效期一年。

運輸：冰袋運輸。

使用方法

1. 裝載探針

【注意】：對于刺激時(shí)間較短（通常2h以?xún)龋┑募毎?，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對照Rosup和/或待研究藥物刺激細胞；對于刺激時(shí)間較長(cháng)（通常6h以上）的細胞，先用活性氧陽(yáng)性對照Rosup或待研究藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

1）檢測前一天進(jìn)行細胞鋪板，確?；钚匝鯔z測當天細胞匯合率達到50~70%。

2）吸出細胞培養液，加入適量體積以及濃度的待研究藥物，于37oC細胞培養箱內孵育，具體誘導時(shí)間根據細胞類(lèi)型和藥物自身特性決定。

【可選】陽(yáng)性對照Rosup：先用無(wú)血清培養液按照1:1000比例稀釋陽(yáng)性對照，通常37℃培養箱內刺激20~30min可以觀(guān)察到顯著(zhù)的活性氧水平提高，但依細胞類(lèi)型會(huì )有比較明顯差異【刺激時(shí)間可參考文獻或實(shí)驗經(jīng)驗來(lái)調整】。如果刺激后30min內未觀(guān)察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過(guò)快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）按照1:1000用無(wú)血清培養液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。吸出細胞培養液，加入適當體積DCFH-DA工作液?！咀⒁狻浚?/strong>加入體積以能充分蓋住細胞為宜。對于6孔板，每個(gè)孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。對于96孔板，每個(gè)孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37oC細胞培養箱內孵育20min。

5）用無(wú)血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進(jìn)入細胞內的DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針

1）按照常規方法，清洗并收集足量的細胞?！咀⒁狻浚?/strong>保證細胞的狀態(tài)健康。

2）用適量體積以及濃度的待研究藥物重新懸浮細胞，于37oC細胞培養箱內孵育，具體誘導時(shí)間根據細胞類(lèi)型和藥物自身特性決定?！?strong>可選】陽(yáng)性對照Rosup：先用無(wú)血清培養液按照1:1000比例稀釋陽(yáng)性對照，通常37℃培養箱內刺激20~30min可以觀(guān)察到顯著(zhù)的活性氧水平提高，但依細胞類(lèi)型會(huì )有比較明顯差異【刺激時(shí)間可參考文獻或實(shí)驗經(jīng)驗來(lái)調整】。如果刺激后30min內未觀(guān)察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過(guò)快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）探針裝載前，按照1:1000用無(wú)血清培養液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。

4）離心，吸出細胞內刺激藥物，之后用適量DCFH-DA工作液重懸細胞，使得細胞密度為1×106~2×107/ml?！咀⒁狻浚?/strong>細胞密度需根據后續檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來(lái)調整。例如，對于流式分析，單管檢測內細胞數目控制在104~ 106之間。

5）37oC細胞培養箱內孵育20min。每隔3~5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

6）用無(wú)血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進(jìn)入細胞內的DCFH-DA。

2. 檢測

2.1 原位裝載法

可用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

2.2 收集細胞后裝載法

可用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察。

3. 參數設置

使用488nm激發(fā)波長(cháng)，525nm發(fā)射波長(cháng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可用FITC的參數設置檢測DCF。

4. 其他說(shuō)明

1）對于某些細胞，若發(fā)現沒(méi)有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使DCFH-DA的工作濃度為2～5μM。探針裝載時(shí)間也可依情況在15～60min內適當進(jìn)行調整。

2）Rosup僅僅用于作為陽(yáng)性對照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入Rosup陽(yáng)性對照。

注意事項

1）探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細胞內的探針，否則會(huì )導致背景較高。

2）探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(cháng)的掃描和發(fā)射波長(cháng)的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3）盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

4）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

附表1 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對各種活性氧物質(zhì)的反應特異性

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