熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺（巰基染料）

Fluorescein-5-maleimide (Thiol Dye)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺（Fluorescein-5-maleimide）是一種活化的熒光分子（Ex/Em=494/518nm），能非常容易的將熒光素連接到蛋白上。馬來(lái)酰亞胺基團在pH 7的最佳體系內與半胱氨酸側鏈上的巰基基團反應，形成一穩定的硫醚鍵。馬來(lái)酰亞胺基團在pH 7時(shí)與游離巰基反應活性比胺基強~1000倍。而在pH＞7.5與伯胺的反應活性提高，且會(huì )發(fā)生馬來(lái)酰亞胺基團水解現象。熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺能用來(lái)標記蛋白，用于檢測構象變化，多亞基復合物的組裝和配基結合過(guò)程。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO：75350-46-8

2） 化學(xué)名：1-(3',6'-Dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen]-5-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione

3） 同義名：5-Maleimido-fluorescein; 5-MF; N-(5-Fluoresceinyl)maleimide; 5-馬來(lái)酰亞胺熒光素；

4） 分子式：C24H13NO7

5） 分子量：427.37

6） 純度：＞97%

7） Ex/Em：494/518nm

8） 外觀(guān)：淺橘色至深橘色和淺紅色至深紅色粉末

9） 溶解性：溶于DMSO、DMF

10）反應基團：馬來(lái)酰亞胺，與巰基反應（pH 6.5-7.5）

11）化學(xué)結構圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，2年有效。

產(chǎn)品使用：【僅做參考】需根據具體應用來(lái)優(yōu)化以下標記步驟。

A、 標記蛋白

1） 于20mM 磷酸鈉緩沖液，150mM NaCl，pH 7.2或其他適合的緩沖液（pH 6.5-7.5）內準備含巰基樣品。為了預防金屬催化生成二硫鍵，體系內加入終濃度5-10mM的EDTA。

2） 往樣品內加入摩爾量遠高的熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺。通常情況，使用25倍高的摩爾比能得到理想結果?！咀⒁狻浚簾晒馑?span>-5-馬來(lái)酰亞胺能直接加入水溶性溶液（高達1mM濃度）或首先溶解在DMF（10mM）在加入蛋白溶液中。

3） 進(jìn)行偶聯(lián)反應，室溫2h或4℃過(guò)夜。

4） 用截留分子量（MWCO）為10 kD的脫鹽柱或透析袋來(lái)去除未結合的熒光素。

5） 將偶聯(lián)好的蛋白或多肽避光保存在4℃，穩定保存高達一個(gè)月?；虬凑諉未斡昧糠盅b，保存在-20℃。

B、 計算標記效率

【注意】：為了得到最佳的結果和精確測定標記率（F/P值），需完全去除未反應的熒光素。有必要稀釋少量脫鹽或透析樣本。

1） 使用1cm比色皿，測定標記蛋白在280nm和495nm處的吸光值。

2） 計算蛋白濃度。

ε=蛋白摩爾吸光系數（比如，IgG的摩爾吸光系數~210,000 M-1cm-1）

Amax=A495

CF=校正系數=A280/Amax=0.3000

×稀釋倍數

3） 計算標記效率

ε′=熒光素摩爾吸光系數：68,000 M-1cm-1

摩爾熒光素/摩爾蛋白= × 稀釋倍數

注意事項：

1.      馬來(lái)酰亞胺對濕度很敏感。需將本品保存在-20℃，保持干燥。開(kāi)蓋前一定要將本品放到室溫回溫，以避免產(chǎn)品受潮而凝結成團。

2.      使用前才配制試劑。不可將試劑保存在水溶液內。

3.      用熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺標記的分子必須含有游離的巰基（-SH）。某些含巰基分子在溶液中可能被氧化，形成二硫鍵，從而不能與馬來(lái)酰亞胺反應。二硫鍵可被還原生成游離巰基。還原后，大部分的還原劑必須在偶聯(lián)反應前去除。

4.      偶聯(lián)反應體系內不要引入含巰基組分，因其會(huì )與馬來(lái)酰亞胺反應，進(jìn)而抑制和降低目的分子的連接率。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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