Fura-FF AM , Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶(hù)，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fura-FF是鈣離子指示劑Fura-2（貨號：NBS7642，貨號：NBS7663）的二氟化衍生物。與Fura-2不同，Fura-FF對鎂離子（Mg²⁺）基本不敏感，減少了該離子帶來(lái)的測定干擾。Fura-FF比Fura-2，呈現出更高的鈣離子解離常數（K_d=6μM versus 0.14μM）。然而，兩者的光譜特征類(lèi)似，體系不含鈣離子時(shí)激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)是365/514nm，當體系含高濃度鈣離子時(shí)激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)遷移到339/507nm。低親和鈣離子染料，包括：Fura-FF，更傾向于研究含高濃度鈣離子的細胞器（比如：線(xiàn)粒體），或具相對較低鈣離子緩沖能力的細胞系統，比如：神經(jīng)元樹(shù)突和神經(jīng)樹(shù)突棘。
  Fura-FF AM是Fura-FF的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養，即可輕易進(jìn)入細胞。一旦進(jìn)入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fura-FF，從而滯留在胞內以發(fā)揮相應生理功能。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：348079-12-9

2）化學(xué)名：2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl] amino]-2,3-difluorophenoxy]ethoxy]-2-benzofuranyl]-5-oxazolecarboxylic acid(acetyloxy)methyl ester

3）同義名：Fura-2FF, AM; Fura-FF, Acetoxymethyl Ester;

4）分子式：C₄₃H₄₃F₂N₃O₂₄

6）最大激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)：365/514 nm（Ca²⁺-free），339/507 nm（high Ca²⁺-bound）

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。 

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱(chēng)取100mg  Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理緩沖液

1） 用無(wú)水DMSO溶解Fura-FF AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Fura-FF AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fura-FF AM中加入12.2μl 無(wú)水DMSO）。準備Fura-FF AM工作液之前，有時(shí)需要往Fura-FF AM儲存液中加入適量的10% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Fura-FF AM染色工作液制備前，添加一定體積的10% Pluronic F-127溶液到Fura-FF AM + DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲存液長(cháng)期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將 Fura-FF AM+DMSO儲存液稀釋到1-20μM的工作液。

【注①】：Fura-FF AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為2-5μM，具體的使用濃度需根據實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fura-FF AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）【可選】如果細胞內（比如CHO細胞）含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone， 0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

4） 將準備好的Fura-FF AM染色工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。室溫或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培養基，血清內酯酶會(huì )降解AM，從而降低Fura-FF AM加載效果。而含酚紅培養基會(huì )使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時(shí)間；如果熒光強度太弱，適當延長(cháng)時(shí)間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會(huì )降低探針的區室化現象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細胞內AM的完全去酯化。

7） 用合適的激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)來(lái)檢測熒光。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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