Rhod-2, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純（NBS7640）

（長(cháng)波長(cháng)的可見(jiàn)光鈣離子探針）

【溫馨提示】：見(jiàn)我司整理的鈣離子載體/探針（Calcium ionophores/indicators）產(chǎn)品專(zhuān)題。

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶(hù)，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產(chǎn)品描述

Rhod-2是一種高親和力的可見(jiàn)光激發(fā)波長(cháng)Ca2+熒光探針。類(lèi)似于Fluo-3或Fluo-4，其激發(fā)和發(fā)射光譜不會(huì )隨著(zhù)Ca2+濃度變化發(fā)生明顯的遷移，熒光信號一旦與Ca2+結合后明顯增強。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波長(cháng)更長(cháng)（Ex/Em=549/578 nm），這一特性使其更適合具高水平自熒光信號細胞或組織的Ca2+水平檢測，還可用來(lái)檢測由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導致的Ca2+釋放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養，即可輕易進(jìn)入細胞。一旦進(jìn)入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，從而滯留在胞內以發(fā)揮相應生理功能。本品以?xún)龈煞鄣男问教峁?，使用時(shí)只需經(jīng)無(wú)水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲存液，并依據具體實(shí)驗和相關(guān)文獻資料調整到需要的工作濃度即可。

主要特征：

1）   長(cháng)波長(cháng)鈣離子探針，能夠與GFP和綠色熒光探針兼容；

2）   特別定位在線(xiàn)粒體。以羅丹明結構為基礎的Rhod-2 AM帶正電荷，以電位驅動(dòng)的方式吸收聚集在線(xiàn)粒體，熒光顯微鏡下觀(guān)察加載進(jìn)入細胞呈現點(diǎn)狀染色模式。有文獻認為，Rhod-2是線(xiàn)粒體Ca2+的選擇性探針，不過(guò)這一理論并未得到廣泛支持。

3）   檢測平臺：熒光成像，流式細胞術(shù)，酶標儀，高內涵篩選（HCS）

基本特性：

1）   CAS NO：129787-64-0

2）   化學(xué)名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3）   同義名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester 

4）   分子式：C52H59N4O19Br

5）   分子量：1123.96

6）   外觀(guān)：紅色固體

7）   最大激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)：549/578 nm

8）   Kd（Ca2+結合）：570NM

9）   溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

10）化學(xué)結構式：

保存與運輸方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

運輸：室溫運輸。

注意事項

1）   熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）   Rhod-2從低濃度Ca2+到高濃度Ca2+的熒光增強程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的熒光信號弱于Fluo-3。

3）   乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

4）   Rhod-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì )凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

5）   Rhod-2, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗效果，盡量在短時(shí)間內使用。

6）   為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據具體的實(shí)驗條件做出調整。

A， 試劑準備

1）  配制Pluronic F-127母液：稱(chēng)取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）   用無(wú)水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Rhod-2, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Rhod-2, AM中加入11.1μl 無(wú)水DMSO）。準備Rhod-2, AM工作液之前，有時(shí)需要往Rhod-2, AM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲存液長(cháng)期保存。

2）   用HHBS或其他生理緩沖液將 Rhod-2, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10μM的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Rhod-2, AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）  【可選】如果細胞內含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當偏堿，因此加入培養基后需要重新調整pH。

4） 將準備好的Rhod-2, AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。37℃孵育20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培養基，血清內酯酶會(huì )降解AM，從而降低Rhod-2, AM加載效果。而含酚紅培養基會(huì )使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細胞死亡較多，適當縮短時(shí)間；如果熒光強度太弱，適當延長(cháng)時(shí)間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會(huì )降低探針的區室化現象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如2.5mM丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細胞內AM的完全去酯化。

7） 用適當的儀器如激光共聚焦、流式細胞儀、熒光酶標儀，以及波長(cháng)Ex/Em=549/578 nm來(lái)進(jìn)行檢測。

Rhod-2 AM的應用實(shí)例：

1）   應用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（NBS7640）檢測順鉑（cisplatin）敏感SKOV3細胞和順鉑耐性SKOV3/DDP細胞內線(xiàn)粒體Ca2+水平的變化。

Fig 1. 順鉑或ATP處理誘導SKOV3細胞線(xiàn)粒體Ca2+內流，并非SKOV3/DDP細胞。A）兩種細胞系分別用ATP誘導處理，時(shí)間序列掃描檢測線(xiàn)粒體Ca2+變化，通過(guò)共聚焦顯微鏡得到數據。B）細胞用6 μg/ml順鉑處理0h，8h和16h后用共聚焦顯微鏡檢測（bar，20 μm）。

2）   應用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（NBS7640）檢測順鉑（cisplatin）對HeLa細胞線(xiàn)粒體Ca2+水平的變化。

Fig 2. 順鉑增加細胞漿和線(xiàn)粒體內游離Ca2+水平。A）HeLa細胞用順鉑（2.5, 5 or 10 μg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Fluo-4 AM孵育。細胞漿Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀(guān)察（bar，40 μm）。B）Fluo-4 AM定量檢測細胞漿內游離Ca2+水平。C）HeLa細胞用順鉑（2.5, 5 or 10 μg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Rhod-2 AM孵育。線(xiàn)粒體Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀(guān)察（bar，40 μm）。D）Rhod-2 A定量檢測線(xiàn)粒體內游離Ca2+水平。

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