Fluo-5N AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶(hù)，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fluo-5N是Fluo-4的結構類(lèi)似物，具更低的鈣結合親和力，使其非常適用于鈣水平在1μM~1mM區間內的胞內鈣離子檢測，而Fluo-3和Fluo-4在這個(gè)區間內的鈣離子反應達到飽和。Fluo-5N與氬離子激光器的488nm激發(fā)光兼容，使其適用于共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀等儀器。激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)分別是494和516nm。一旦與鈣離子結合，熒光強度增加大于100倍，波長(cháng)遷移非常少。

Fluo-5NAM是Fluo-5N的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養，即可輕易進(jìn)入細胞。

產(chǎn)品特性

1）同義名：Fluo-5N, Acetoxymethyl Ester;

2）分子式：C50H47F2N3O25

3）分子量：1127.92

4）Ex/Em：494/516nm（Ca2+-bound）

5）解離常數：~90μM

6）純度：≥95% (HPLC)

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A，試劑準備

1）配制Pluronic F-127母液：稱(chēng)取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）用無(wú)水DMSO溶解Fluo-5NAM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Fluo-5NAM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-5NAM中加入11μl無(wú)水DMSO）。準備Fluo-5NAM工作液之前，有時(shí)需要往Fluo-5NAM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強AM探針的水溶性。

【注①】：Fluo-5N AM染色工作液制備前，添加一定體積的20% Pluronic F-127溶液到Fluo-5NAM+ DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

2）用HHBS或其他生理緩沖液（含鈣鎂）將Fluo-5NAM+DMSO儲存液稀釋到1-20μM的工作液。

【注①】：Fluo-5N AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

3）【可選】如果細胞內（比如CHO細胞）含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細胞培養基內，以降低去酯化探針的泄露水平。

4）將準備好的Fluo-5NAM染色工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。室溫或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培養基，血清內酯酶會(huì )降解AM，從而降低Fluo-5NAM加載效果。而含酚紅培養基會(huì )使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細胞清洗2~3次。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6）室溫再孵育30min以保證細胞內AM的完全去酯化。

7）用合適的激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)來(lái)檢測熒光。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fluo-5NAM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì )凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fluo-5NAM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗效果，盡量在短時(shí)間內使用。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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