活細胞/死細胞雙染色試劑盒 

CALCEIN-AM/PI LIVE/DEAD CELL DOUBLE STAIN KIT（NBS2015）

【溫馨提示】：見(jiàn)我司整理的Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專(zhuān)題，尋找最合適波長(cháng)的鈣黃綠素活細胞探針。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

活細胞/死細胞雙染色試劑盒 Calcein-AM/PI Live/Dead Cell Double Stain Kit是一種非常便捷的基于Calcein-AM (鈣黃綠素)和PI (碘化丙啶)雙熒光染色法檢測動(dòng)物細胞死活的試劑盒，熒光染色和檢測僅需約30分鐘。染色30分鐘后就可進(jìn)行后續的熒光顯微鏡拍照、流式分析或者熒光酶標儀定量等熒光檢測和分析。本試劑盒的原理是兩種探針可分別檢測細胞內酯酶活性和細胞膜完整性，從而反映細胞活性與細胞毒性。其中Calcein AM染色活細胞，呈現綠色熒光；而碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色死細胞，呈現紅色熒光。本試劑盒用于檢測動(dòng)物細胞活性與細胞毒性效果參考圖1。

圖1. 活細胞/死細胞雙染色試劑盒 Calcein-AM/PI Live/Dead Cell Double Stain Kit用于HT-29(人結腸癌細胞)細胞活性與細胞毒性檢測的效果圖。HT-29細胞在明場(chǎng)視野下仔細觀(guān)察可以看到有明顯的壞死細胞(圖A)；綠色熒光標記的即為Calcein染色的活細胞(圖B)，紅色熒光標記的即為PI染色的死細胞(圖C)；Calcein和PI雙染疊加(merge)后可以非常清晰地觀(guān)察到活細胞和死細胞的熒光染色差別(圖D)。在本實(shí)驗中，HT-29細胞經(jīng)TSZ處理4小時(shí)。TSZ為T(mén)NFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細胞程序性壞死誘導試劑。實(shí)測數據會(huì )因實(shí)驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱(chēng)為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是一種可以對活細胞進(jìn)行熒光染色的細胞染色試劑，Calcein AM是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團，加強了疏水性，因此能夠很容易穿透細胞膜。Calcein AM本身并沒(méi)有熒光，進(jìn)入細胞后被活細胞中內源性酯酶水解生成具有強負電荷的不能通透細胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細胞內，而Calcein可發(fā)出強綠色熒光。由于死細胞缺乏酯酶或酯酶活性很低，Calcein AM進(jìn)入細胞后含有酯酶的活細胞可以產(chǎn)生Calcein，而死細胞不能或很少能產(chǎn)生Calcein，因此僅活細胞會(huì )被染色為強綠色熒光，死細胞不能被染色或者染色非常弱。核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細胞的細胞膜，而只能染色細胞膜完整性被破壞的死細胞。因此，Calcein AM與碘化丙啶聯(lián)合使用，對活細胞和死細胞同時(shí)進(jìn)行雙重熒光染色，就能用于細胞活性與細胞毒性的檢測。Calcein AM水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長(cháng)為494nm，最大發(fā)射光波長(cháng)為517nm；PI-DNA復合物的最大激發(fā)光波長(cháng)為535nm，最大發(fā)射光波長(cháng)為617nm。Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本試劑盒可以用于大多數的哺乳動(dòng)物細胞的檢測。有報道稱(chēng)Calcein AM也可以用于一些植物細胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細胞(root border-like cells)、一些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae和一些寄生蟲(chóng)如Leishmania。由于一些寄生蟲(chóng)細胞膜組分比較特殊的原因，Calcein AM不能進(jìn)入相應的活細胞，但可以進(jìn)入凋亡早期的寄生蟲(chóng)細胞，從而與PI聯(lián)用可以用于檢測凋亡早期的寄生蟲(chóng)細胞。由于真菌和細菌有細胞壁，會(huì )阻礙Calcein進(jìn)入細胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細菌。本試劑盒與類(lèi)似用途的臺盼藍染色液相比，更快捷且靈敏度更高。

本試劑盒提供的Calcein AM和PI為1000X溶液，使用非常便捷。并且這兩種溶液都經(jīng)過(guò)優(yōu)化，對大多數細胞都適用，但為得到比較理想的結果，也可根據細胞類(lèi)型和實(shí)驗實(shí)際情況對Calcein AM或PI在500-2000稀釋倍數之間進(jìn)行適當調整。同時(shí)，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時(shí)間內維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營(yíng)養，效果比PBS或HBSS更好。對于96孔板，按推薦稀釋倍數配制相關(guān)檢測試劑，且每孔使用100μl，此時(shí)本試劑盒的小包裝、中包裝和大包裝分別可以檢測100次、500次和2500次。

保存條件: 

-20℃保存，一年有效。

Calcein AM (1000X)和PI (1000X)需要避光保存。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1. Calcein AM/PI檢測工作液的配制:

按照96孔板每孔100μl Calcein AM/PI檢測工作液的體系，參考下表配制適量的Calcein AM/PI檢測工作液，并充分混勻。

注1：為得到比較理想的結果，可根據細胞類(lèi)型和實(shí)際染色效果對Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀釋倍數之間進(jìn) 行適當調整。

注2：配制好的Calcein AM/PI檢測工作液必須一次使用完畢，不能凍存。

注3：也可以用其它合適的溶液，如無(wú)血清培養液、HBSS或PBS稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒 配套提供的檢測緩沖液可在一段時(shí)間內維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營(yíng)養，效果通常比PBS或HBSS更好。

2. 熒光顯微鏡檢測：

a. 接種培養。將細胞接種于96孔板等多孔板、細胞培養皿中或者細胞爬片上，按實(shí)驗設計對細胞進(jìn)行一定處理。

b. 洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養液，用PBS洗滌細胞1遍；對于懸浮細胞，250

-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用 PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養液和PBS時(shí)最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。

c. 染色。加入適當體積的Calcein AM/PI檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500 μl，6孔板每孔加入1ml。37oC避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育時(shí)間有所不同，以30min作為初始孵育時(shí)間，后續可以 根據實(shí)際染色效果對染色時(shí)間進(jìn)行適當調整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。

d. 檢測。孵育結束后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=

494/517nm；PI為紅色熒光， Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復染， 例如使用Hoechst 33342（CAT：NBS8032 和 CAT：NBS8033）活細胞染色液染色細胞核等。注意整個(gè)過(guò)程均需注意避光操作。

3. 流式細胞儀檢測：

a. 細胞準備。貼壁細胞胰酶消化后用培養液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗 滌一次。每個(gè)樣品推薦的細胞用量為106個(gè)細胞。

b. 染色。對于上一步驟的106個(gè)細胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI檢測工作液，重懸為單細胞懸液。37oC避光孵育30min。 注：需要準備好僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時(shí)的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM/PI檢測工作液的緩沖 液宜保持一致。同時(shí)準備兩管額外的細胞樣品，每管只加入一種染料(Calcein AM或PI)，用于流式單染的補償調節。

c. 檢測。孵育完成后，可以直接進(jìn)行流式細胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細胞，吸凈液體后每個(gè)樣品加入 0.5ml 緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光， Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色，例如使用Hoechst 33342活細胞染色液染色細胞核等。注意整個(gè)過(guò)程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時(shí)內進(jìn)行流式細胞儀檢測和分析。

注1：使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。 注2：細胞圈門(mén)(gate)時(shí)，注意不要圈入細胞碎片，并使用Calcein AM或PI單染的細胞進(jìn)行調節補償。雙染細胞流式檢測應獲 得兩個(gè)相對獨立的細胞群：綠色熒光的活細胞群和紅色熒光的死細胞群。

注3：由于流式檢測比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測時(shí)要低，此時(shí)可根據細胞類(lèi)型和實(shí)際染色情況對 Calcein AM或PI的稀釋倍數進(jìn)行適當調整。

4. 熒光酶標儀檢測細胞死活的變化：

a. 接種培養。將細胞接種于96孔板黑色多孔板中，如全黑96孔細胞培養板，每孔的細胞數需要控制在 100-10,000個(gè)，通常宜在2000-5000個(gè)范圍內。按實(shí)驗設計對細胞進(jìn)行一定處理。

b. 洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養液，用PBS洗滌細胞1遍；對于懸浮細胞，250

-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用 PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養液和PBS時(shí)最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的 情況下，可以不使用PBS洗滌。

c. 染色。加入適當體積的Calcein AM/PI檢測工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37oC避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育 時(shí)間有所不同，以30min作為初始孵育時(shí)間，后續可以根據實(shí)際染色效果對染色時(shí)間進(jìn)行適當調整和優(yōu)化，以得到更加理想的 染色效果。 d. 檢測。孵育結束后，用熒光酶標儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。 通過(guò)對比對照組與處理組的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死細胞與活細胞數量的變化。

5. 熒光酶標儀檢測細胞死活的比例：本方法通過(guò)設置對照，可計算出死細胞與活細胞的比例。 a. 細胞培養和處理同前。

b. 除配制Calcein AM/PI檢測工作液外，還需要配制單獨的Calcein AM檢測工作液和PI檢測工作液用于對照的檢測。配制方法和稀釋倍數與Calcein AM/PI檢測工作液的配制一致。

c. 檢測樣品組和對照組設置：

對于下面組別的細胞或無(wú)細胞組，需要保持細胞數量、檢測工作液濃度、孵育時(shí)間和孵育溫度的完全一致。

活細胞組為沒(méi)有加入藥物處理的細胞；死細胞組可用0.1-0.5%洋地黃皂苷或0.1%皂素處理細胞10分鐘，或70%乙醇 孵育細胞30分鐘即可得到死細胞。

d. 染色和檢測步驟同前。

e. 根據檢測數據計算死細胞與活細胞的比例：

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      Calcein AM (1000X)在潮濕環(huán)境中容易分解，首次使用時(shí)建議適當分裝并-20℃密封保存。

3.      由于Calcein AM在水溶液中不穩定，Calcein AM檢測工作液須現配現用，不能配制后凍存。

4.      培養液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色可能有一定的影響，使熒光背景增強，建議在加入Calcein AM檢測工作液前適當洗滌細胞。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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