Calcein, AM, Ultra Pure Grade 鈣黃綠素（綠色，超純級別）

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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性的活細胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團的存在不僅加強疏水性，使其能輕易穿透活細胞膜。而且封閉結合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進(jìn)入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內鈣離子結合，產(chǎn)生強烈的綠色熒光。因不具有細胞膜滲透性，從而被保留在胞內。與其它活細胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細胞染色探針，因細胞毒性很低，而且不會(huì )抑制任何細胞功能如增殖或淋巴細胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測的實(shí)驗結果十分可信，與標準的51Cr釋放法所得結果一致。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對活細胞進(jìn)行標記，這一特征使其非常適合用來(lái)檢測細胞活力和細胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過(guò)死細胞膜的無(wú)序區域到達細胞核，嵌入細胞的DNA雙螺旋區域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀(guān)察活細胞和死細胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀(guān)察到死細胞。結合這些特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。

本品以粉末形式提供，超純級別（≥95%），可與碘化丙啶PI（貨號：NBS1207-10MG）聯(lián)合使用，進(jìn)行活細胞和死細胞的雙重染色。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO：148504-34-1

2） 同義名：鈣黃綠素乙酰甲酯；3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光素，二乙酰甲酯；

3） 分子式：C46H46N2O23

4） 分子量：994.86

5） 純度：≥95%（HPLC）

6） 外觀(guān)：白色或淺黃色結晶粉末

7） 溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥保存，避免強光直射，有效期一年。

產(chǎn)品使用：

A， 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來(lái)決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往50μg Calcein，AM（Mw：994.86）內加入10μl 細胞培養級別的DMSO即可。

B， 20% Pluronic F-127制備【可選】

稱(chēng)取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

C， 染色步驟

大多數實(shí)驗體系中Calcein, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗建議做梯度實(shí)驗，以確定Calcein, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1） 取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時(shí)可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲存液內來(lái)增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長(cháng)期保存，需現配現用。

2） 對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

3） 去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4） 用1/10細胞培養基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育15～30min。

【注意】：若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低Calcein泄露到胞外。

5） 用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來(lái)進(jìn)行細胞清洗。用含合適濾光片（Ex/Em= 490nm/515nm）的熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein-AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein-AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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