Cell-Tracker細胞示蹤/細胞追蹤熒光探針專(zhuān)題

（Cell-Tracker Fluorescent Probes）

背景需求：

細胞運動(dòng)和定位研究需要專(zhuān)門(mén)的探針染料，首先必須要對活細胞無(wú)毒性，還要同時(shí)具有多種熒光顏色可供選擇，以便與不同的儀器激光波長(cháng)和濾光片匹配并能與抗體標記或其他細胞分析標記探針共染色。

檢測細胞運動(dòng)和定位的最簡(jiǎn)單方法就是使用具有膜通透性的探針染料進(jìn)入細胞并在加載后轉變?yōu)槟し峭ㄍ感缘漠a(chǎn)物。理想的細胞示蹤染料需要可存留于分裂多代后的子細胞中，但不會(huì )通過(guò)接觸轉移到相鄰細胞中。Cell-Tracker系列示蹤染料就是在這樣的背景下開(kāi)發(fā)而來(lái)：在工作濃度下保持穩定且無(wú)細胞毒性，可穩定存留在細胞中，且在生理 pH 條件下可發(fā)出明亮的熒光。Cell-Tracker示蹤熒光染料還具有多種發(fā)射光譜，可輕松與抗體標記結合使用。

產(chǎn)品描述：

Cell-Tracker熒光探針是用來(lái)監測細胞運動(dòng)、定位、增殖、遷移、趨化和侵襲的優(yōu)秀工具。

Cell-Tracker熒光探針能自由穿透細胞膜進(jìn)入細胞，在胞內轉化生成不具細胞膜滲透性的反應產(chǎn)物。Cell-Tracker熒光探針（除了Cell-Tracker Deep Red）含有一氯甲基或溴甲基基團，與巰基反應，利用谷胱甘肽S轉移酶介導的催化作用。大多數細胞中谷胱甘肽含量很高（高達10mM），谷胱甘肽轉移酶普遍存在。Cell-Tracker Deep Red含一琥珀酰亞胺酯反應基團，與蛋白上的胺基反應。一旦轉化為不可逆產(chǎn)物，這些產(chǎn)物幾次傳代都能良好的保留在活細胞中。在細胞群內，染料只會(huì )轉移到子代細胞，不會(huì )轉移到鄰近細胞。

Cell-Tracker探針特地設計使其至少72h（典型有3~6代）能展示熒光，此染料表現出理想的示蹤特征：穩定、工作濃度下無(wú)毒性、良好保留在細胞，且在生理pH下呈明亮熒光。

重要特征：

① 可快速加載標記（通常 15 分鐘至 1 小時(shí)）

② 短期追蹤（一般 3-6代或72h）

③ 具有較強的耐光漂白/抗光淬滅特性

④ 熒光信號亮度適中

⑤ 信號分布于整個(gè)細胞

⑥ 適合熒光顯微鏡和HCS檢測

⑦ 提供多種發(fā)射光譜的Cell-tracker示蹤探針，適合多標實(shí)驗（見(jiàn)表1）。

表1. Cell-Tracker熒光探針的光譜特征

染色示例：

Fig 1. Co-culture of CellTracker? labelled fibroblasts (green) and hESMPs (red) on bilayer membranes of either PHBV–PLA or PHBV–PCL. （Ref.：Frazer J. Bye et al. Development of bilayer and trilayer nanofibrous/microfibrous scaffolds for regenerative medicine. Biomater. Sci., 2013, 1, 942-951.

Fig 2. Measuring O2 exchange in RBCs using single-cell O2-saturating imaging. (C) Wild-type RBCs loaded with a mixture of Deep-Red and Green, showing fluorescence in oxygenated and deoxygenated microstreams. （Ref.：Sarah L. Richardson, Alzbeta Hulikova, Melanie Proven, Ria Hipkiss, Magbor Akanni, Noémi B. A. Roy, Pawel Swietach. Single-cell O2 exchange imaging shows that cytoplasmic diffusion is a dominant barrier to efficient gas transport in red blood cells.Proceedings of the National Academy of Sciences May 2020, 117 (18) 10067-10078;）

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常見(jiàn)問(wèn)題：

① 我的實(shí)驗需要做細胞遷移研究（約4h），需要對細胞做熒光標記，有推薦的產(chǎn)品?

比如：可選擇鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）和二乙酸熒光素（FDA）（CAT NO. NBS0425）來(lái)做此用途。由于這些染料不會(huì )插入或共價(jià)結合到任何其它細胞成分，它們在胞內的滯留時(shí)間比較短，因為某些細胞類(lèi)型可能極其活躍的將染料泵出細胞。像Cell-Tracker系列染料，包含要么溫和巰基反應的氯甲基基團要么胺基反應的NHS基團，使得探針共價(jià)結合到細胞內容物中，使得具更好的滯留效果。不管是哪種探針，用戶(hù)根據經(jīng)驗來(lái)確定在所用細胞類(lèi)型內的滯留時(shí)間。

② 我的實(shí)驗用Calcein AM來(lái)標記細胞，但第二天成像，發(fā)現沒(méi)有熒光信號，為什么？

鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）是良好的細胞示蹤探針，以及常用的細胞質(zhì)染料。但，不會(huì )與胞內內含物結合，可能幾個(gè)小時(shí)就會(huì )被細胞泵出體外。鈣黃綠素在活細胞內的滯留時(shí)間取決于不同細胞的內在特征和培養條件。

如果要做長(cháng)期成像，更推薦使用具反應性的細胞質(zhì)染料比如：CFDA SE或Cell-tracker示蹤探針。

③我的實(shí)驗對兩種細胞染色，一種用Cell-tracker green，一種用Cell-tracker Red，但看起來(lái)紅色與綠色染色細胞間有交叉干擾，為什么？

一種可能性是染料間存在光譜滲透?？赏ㄟ^(guò)檢查單一染色細胞，比如：對于紅色染料標記細胞，用綠色熒光來(lái)檢測；對于綠色染料標記細胞用紅色熒光來(lái)檢測，用另一種顏色的對應濾片來(lái)成像檢測。通過(guò)對這些對照的觀(guān)察，發(fā)現有光譜滲透，可通過(guò)降低染料標記濃度來(lái)降低染料亮度，或使用光譜間隔更大的染料重新標記。如果不存在光譜滲透，還有一種可能性是染色后細胞并未充分清洗，使得某些未插入的染料保留在新的染色體系內進(jìn)而標記上其它細胞。增加清洗次數和延長(cháng)時(shí)間有可能改變這個(gè)問(wèn)題。