細胞膜熒光探針（Tracers for Membrane Labeling）產(chǎn)品專(zhuān)題

（DiI，DiO，DiD，DiR，DiA，Celltracker CM-DiI）

傳統細胞膜探針：

A，DiI, DiO, DiD和DiR：

DiI, DiO, DiD和DiR作為一類(lèi)長(cháng)鏈的親脂性二烷基碳菁類(lèi)染料(Dialkylcarbocyanines)熒光染料家族，用于標記細胞膜以及其他脂溶性生物結構，尤其是DiI，廣泛用于活體和固定組織及細胞的神經(jīng)元逆行性和順行性示蹤。

作為一類(lèi)環(huán)境敏感型熒光染料，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強度很弱）結合時(shí)，其熒光強度顯著(zhù)增強。一旦進(jìn)入細胞后，它們在細胞內質(zhì)膜中逐步擴散，最佳濃度條件下可將整個(gè)細胞染色。這些染料具很高的淬滅系數，偏光依賴(lài)性和很短的激發(fā)壽命。

四種染料呈現不同的熒光顏色，DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術(shù)提供了一種便捷的工具。DiO和DiI分別用標準FITC和TRITC濾光器檢測，可結合使用。DiD可被633 nm氦-氖（He-Ne）激光激發(fā)，具有比DiI更長(cháng)的激發(fā)和發(fā)射光波長(cháng)，特別適合用于標記具本底熒光的細胞和組織。而，DiR在體內活體成像或者示蹤中意義非凡，因其所發(fā)射的紅外光可以高效地穿過(guò)細胞和組織，并且在紅外光范圍內，其本底熒光水平很低。

Fig. DiO（NBS5128）、DiI（NBS5129）、DiD（NBS5131）、DiR（NBS5132）結合到磷脂雙分子層上的標準化熒光發(fā)射光譜圖。

B， DiA：

DiA為親脂性氨基苯乙烯基染料（dialkylaminostyryl dye），常用于神經(jīng)元的示蹤，可與DiI聯(lián)合使用進(jìn)行神經(jīng)細胞的雙色標記。研究發(fā)現，某些情況下當DiO不能標記固定組織時(shí)，DiA可得到良好標記效果。DiA與磷脂雙層膜結合后，光譜遷移明顯加強。正由其發(fā)射光譜非常廣，在適當的濾光片下，可以綠色、橙色，甚至紅色熒光被檢測到。 

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C，CM-DiI（活細胞的多代示蹤、固定細胞長(cháng)期示蹤）,改良的細胞膜探針：

Cell-Tracker CM-DiI為DiI的衍生物，在DiI中加入了具有中度巰基反應特性的氯甲基取代物，后者能與細胞內含巰基的肽和蛋白結合，使得CM-DiI能夠抵抗醛類(lèi)的固定作用。CM-DiI在細胞固定、破膜及石蠟包埋的整個(gè)過(guò)程中均能很好的保留在細胞內，因此，與傳統細胞膜探針DiI相比較，更適于固定后標本的長(cháng)期示蹤。其紅色/綠色的光譜特征，使其可與綠色探針或者綠色熒光蛋白如GFP一起用于雙標實(shí)驗。

Cell-Tracker CM-DiI具以下特征：a）使用方便，只需吸掉培養液，加入探針，30min孵育，顯微成像；b）熒光信號至少可持續72h以上（一般3-6代），染料只傳到子代細胞，不會(huì )染上鄰近細胞。c）毒性很低，不會(huì )影響細胞增殖和活力?？偠灾?，Cell-Tracker CM-DiI具有良好的示蹤特征，對細胞無(wú)毒，穩定長(cháng)效，染料很好保留在細胞內，生理pH熒光信號強。

研究證實(shí)，CM-DiI標記后熒光在胞內表達穩定，陽(yáng)性標記率達98%以上，標記細胞形態(tài)良好，能有效地觀(guān)察細胞在體外的誘導分化情況；或將標記的細胞注入體內，可以有效的顯示移植細胞在活體組織中的遷移及分化。 

細胞膜探針光譜和檢測濾片：1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiA濾光器的選擇參見(jiàn)下表：

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D. DiIC18(3)-DS/DiIC18(5)-DS（磺酸化的碳菁類(lèi)染料）

由于弱水溶性，通常很難加載長(cháng)鏈碳菁類(lèi)染料比如DiI、DiO和PKH到懸浮細胞內。為了應對此處難題，我司開(kāi)發(fā)出磺酸化的碳菁類(lèi)染料（Sulfonated Carbocyanines）-DiIC18(3)-DS和DiIC18(5)-DS，在維持DiI和DiD的18碳親脂鏈的基礎上，改善其在細胞培養基內的水溶性。只需簡(jiǎn)單的將這些染料的DMSO儲存液稀釋到原培養基內（工作濃度范圍1~10uM）即可完成探針的加載?；罴毎麑﹃庪x子碳菁類(lèi)染料的吸收速率明顯慢于陽(yáng)離子碳菁類(lèi)染料，得到的染色結果可能差異較大。

某些應用要求經(jīng)過(guò)以醛類(lèi)為媒介的固定和脂質(zhì)提取后膜染料還能保留在原位。與DiO、DiD或PKH染料標記相比，某些磺酸化的碳菁類(lèi)染料似乎與標準醛類(lèi)為基礎的固定方法和丙酮處理兼容，至少在某些細胞系內。

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應用文獻：

1.  Hemmrich Ket al,Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering.Cells Tissues Organs. 2006; 184(3-4):117-27.

2.  Andrade W, et al, The use of the lipophilic fluorochrome CM-DiI for tracking the migration of lymphocytes.J Immunol Methods. 1996 Aug 14;194(2):181-9.

3.  Schatteman GC, et al,Blood-derived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabetic mice.J Clin Invest. 2000 Aug; 106(4):571-8.

4.  Foley-Comer AJ, et al, Evidence for incorporation of free-floating mesothelial cells as a mechanism of serosal healing.J Cell Sci. 2002 Apr 1;115(Pt 7):1383-9.

5.  Djouad F, et al,Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals.Blood. 2003 Nov 15;102(10):3837-44. Epub 2003 Jul 24.

6.  Hosie KA, et al,Chronic excitotoxin-induced axon degeneration in a compartmented neuronal culture model.ASN Neuro. 2012 Feb 23;4(1). pii: e00076. doi: 10.1042/AN20110031.

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。