?????????????產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

潮霉素B（Hygromycin B），從吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）分離到的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素。通過(guò)與30S核糖體亞基結合，誘導對mRNA模板的錯讀且抑制易位，從而以阻止蛋白合成。潮霉素B能殺死細菌、真菌和高等真核細胞。主要用來(lái)篩選和維持培養穩定轉染Hph載體的原核細胞或真核細胞（植物細胞和哺乳動(dòng)物細胞）。

對潮霉素B（Hygromycin B）的抗性來(lái)源于大腸桿菌潮霉素抗性基因（hph或hyg），該基因能編碼潮霉素磷酸轉移酶（hygromycin phosphotransferase），使得潮霉素B發(fā)生磷酸化從而失去活性。目前Hph抗性基因主要有兩種來(lái)源，最初來(lái)源是大腸桿菌（Escherichia coli），另一來(lái)源是潮霉素B產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）。如今，攜帶Hph抗性的載體大多來(lái)自大腸桿菌。

我司提供兩種產(chǎn)品形式的潮霉素B。

一種以?xún)龈煞坌问教峁?，貨號分別為：NHB0003-1G，NHB0003-5G，NHB0003-10G。需要配制成儲存液后備用。

一種以溶于PBS的無(wú)菌液體形式提供，貨號為NHB0003-20ML，使用更簡(jiǎn)單方便。

產(chǎn)品特性

1）化學(xué)名：O-6-Amino-6-deoxy-L-glycero-D-galacto-heptopyranosylidene-(1-2-3)-O-β-D-talopyranosyl(1-5)- 2-deoxy-N3-methyl-D-streptamine

2）同義名：Hygromycin B, from Streptomyces hygroscopicus 潮霉素質(zhì)B，來(lái)源于吸水鏈霉菌

3）CAS NO：31282-04-9

4）分子式：C20H37N3O13

5）分子量：527.53g/mol

6）  外觀(guān)：類(lèi)白色至白色粉末

7）純度：≥90%（HPLC）

8）效價(jià)：≥1050 U/mg

9）化學(xué)結構：

保存與運輸方法

保存：粉末-20℃干燥保存，2年有效。溶液2-8°C避光保存，1年有效。

運輸：冰袋運輸。

使用方法

1. 儲存液制備

1）潮霉素B（粉末形式）：稱(chēng)取適量粉末溶于1×PBS配制成50mg/ml溶液，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，置于2-8°C避光保存。

2）潮霉素B（溶液形式）：已是無(wú)菌儲存液，直接用細胞培養液稀釋到工作濃度即可使用。

2. 建議工作濃度

潮霉素B用來(lái)篩選穩定轉染細胞株的工作濃度需要根據細胞類(lèi)型，培養基，生長(cháng)條件和細胞代謝率而變化。

1）哺乳動(dòng)物細胞使用濃度為50-1000 μg/ml，常用篩選濃度為200 μg/ml，最佳濃度需要殺滅曲線(xiàn)來(lái)確定。

2）植物細胞常用濃度：20-200 μg/ml；

3）細菌常用濃度：20-200 μg/ml；

4）真菌常用濃度：200-1000 μg/ml；

3. 殺滅曲線(xiàn)的建立

建議初次實(shí)驗一定要建立殺滅曲線(xiàn)（kill curve），至少設立5個(gè)濃度，篩選到適合自身實(shí)驗體系的最佳濃度。

1）將未轉化細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，鋪足夠的孔以保證后續的梯度實(shí)驗。37℃培養過(guò)夜；【注意】：對于需要更高密度以保證活力的細胞，增加接種量。

2）第二日，用含梯度濃度潮霉素B的培養基替換舊培養基。比如，哺乳動(dòng)物細胞常用濃度為50-1000μg/ml，可設50, 100, 250, 500, 750, 1000μg/m這6個(gè)濃度，各3個(gè)平行。同時(shí)設置一陰性對照，3個(gè)平行。

3）接下來(lái)每3-4日更換新鮮的含抗生素培養基。

4）按照固定周期（如每2天）進(jìn)行活細胞計數來(lái)確定阻止未轉化細胞生長(cháng)的恰當濃度。選擇在理想天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選所需的工作濃度。

4、穩轉細胞的篩選

1）轉染48h后，用含最佳篩選濃度潮霉素B的培養基進(jìn)行細胞傳代?！咀⒁狻浚?/span>細胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。當細胞密度過(guò)高，篩選效率會(huì )降低。為了得到較好的篩選效果，建議將細胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2）每3-4日更換新鮮的含抗生素培養基。

3）篩選7天后觀(guān)察并評估細胞集落的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這些取決于宿主細胞類(lèi)型，轉染，以及篩選效果。

4）挑取5-10個(gè)抗性克隆到35mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

5）之后換用正常培養基培養即可。?????????????