JC-10線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒

JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

JC-10線(xiàn)粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-10為熒光探針，快速且靈敏的檢測細胞、組織或純化線(xiàn)粒體膜電位變化的試劑盒。因線(xiàn)粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個(gè)標志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-10是一種新型的用來(lái)監測線(xiàn)粒體膜電位變化的熒光探針，是JC-1的優(yōu)越替代物。與JC-1相比，具有以下幾個(gè)重要優(yōu)勢：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明顯降低；2）使用更方便——簡(jiǎn)化步驟將手動(dòng)操作時(shí)間最小化；3）熒光信號更高——改良的信號與背景熒光的信噪比；4）結果更穩定——優(yōu)化探針以保證更連續性和穩定性結果。

JC-10是一種替換JC-1，用于檢測線(xiàn)粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。JC-10以電勢依賴(lài)性的方式積聚在線(xiàn)粒體內，可以用來(lái)檢測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位。正常線(xiàn)粒體內，JC-10聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線(xiàn)粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線(xiàn)粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線(xiàn)粒體的去極化程度可以通過(guò)紅/綠熒光強度的比例來(lái)衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線(xiàn)粒體膜電位喪失的陽(yáng)性對照。對于六孔板樣品，本試劑盒可檢測100個(gè)樣品。

保存條件: 

-20℃保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1. C-10染色工作液制備

對于六孔板，每孔所需 JC-10 染色工作液的量為1ml，其他培養器皿的JC-10 染色工作液的用量以此類(lèi)推；對于細胞懸液每50～100萬(wàn)細胞需0.5mL JC-10染色工作液。

取適量JC-10（200×），按照每50μL JC-10（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-10。然后再加入2mL JC-10 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-10染色工作液。

【注意】：必須先把JC-10（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后，才可加入JC-10染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-10染色緩沖液（1×）再加入JC-10（200×），這樣JC-10會(huì )很難充分溶解，會(huì )嚴重影響后續的檢測。

2.  陽(yáng)性對照的設置

CCCP（10mM）推薦按1∶1000 的比例加入到細胞培養液中，稀釋至10μM，處理細胞20min。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線(xiàn)粒體膜電位的檢測。

對于大多數細胞，通常10μM CCCP處理20 min后線(xiàn)粒體的膜電位會(huì )完全喪失，JC-10 染色后觀(guān)察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-10 染色后應顯示綠橙色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定。

3. 對于懸浮細胞

1） 取10～60萬(wàn)細胞，重懸于0.5mL 細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅。

2） 加入0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期間，按照每1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）  37℃孵育結束后，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5） 用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。再加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。

6）   再用適量JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4. 對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的方法進(jìn)行檢測。

1） 對于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養液，根據具體實(shí)驗如有必要可用PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL 細胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅。

2） 加入1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期間，按照每1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4） 37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。

5） 加入2mL 細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。

6） 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。

5.  對于純化的線(xiàn)粒體

1） 將配制好的JC-10 染色工作液再用JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。

2） 0.9mL 5 倍稀釋的JC-10 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線(xiàn)粒體。

3） 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長(cháng)為490nm，發(fā)射波長(cháng)為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長(cháng)不能設置為490nm 時(shí)，可在475～520nm 范圍內設置激發(fā)波長(cháng)。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長(cháng)設置進(jìn)行熒光檢測。

4） 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察：方法同下面的步驟6。

6. 熒光觀(guān)測和結果分析

檢測 JC-10 單體時(shí)可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為525nm；檢測JC-10聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設置為540nm，發(fā)射光設置為595nm。

【注1】：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在最大激發(fā)波長(cháng)和最大發(fā)射波長(cháng)。如使用熒光顯微鏡觀(guān)察，檢測JC-10聚合物時(shí)可使用常來(lái)檢測TRITC用的標準帶通濾波器。檢測JC-10單體可使用常來(lái)檢測FITC或GFP的標準帶通濾波器。出現綠色熒光說(shuō)明線(xiàn)粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現綠橙色熒光說(shuō)明線(xiàn)粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

【注2】：由于紅色的JC-10信號淬滅比綠色快，所以用標準帶通濾波器檢測時(shí)先檢測紅色熒光。

注意事項：

1.      JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì )凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2.      裝載完JC-10后用JC-10染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使JC-10染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時(shí)洗滌效果較好。

3.      JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30min內完成后續檢測。在檢測前需冰浴保存。

4.      請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用JC-10染色緩沖液（5×）。

5.      如果發(fā)現JC-10染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在37℃加熱促進(jìn)溶解。

6.      CCCP為線(xiàn)粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

7.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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