嘌呤霉素

Puromycin dihydrochloride

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

嘌呤霉素（Puromycin），來(lái)源于白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）代謝產(chǎn)物的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(cháng)，對抗酸桿菌的抑制活性相對較弱，但對革蘭氏陰性菌的抑制活性更弱。還能抑制原生生物、藻類(lèi)、哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細胞的生長(cháng)，一般2天內能殺死99%的細胞。作用機制在于：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的結構類(lèi)似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結合并摻入到延伸肽鏈中，導致肽鏈合成的永久終止，進(jìn)而阻止蛋白質(zhì)合成。嘌呤霉素還具有抗腫瘤活性。作為蛋白合成抑制劑，用來(lái)研究細胞分化中控制基因順序表達和協(xié)同表達的轉錄調控機制。

對嘌呤霉素的抗性來(lái)自嘌呤霉素產(chǎn)生菌內發(fā)現的pac基因，其表達產(chǎn)物嘌呤霉素N-乙酰轉移酶（puromycin N-acetyl-transferase）可通過(guò)乙?；堰拭顾厥蛊涫Щ?。這一特性使得嘌呤霉素常用來(lái)篩選和維持培養攜帶pac基因的哺乳動(dòng)物細胞株，特別是慢病毒感染的細胞株?，F在商業(yè)化的慢病毒載體多數都攜帶pac基因。某些情況下，也能用來(lái)篩選攜帶pac基因的大腸桿菌菌株。嘌呤霉素在CRISPR/Cas9基因編輯系統中也發(fā)揮重要作用。

本品為嘌呤霉素的二鹽酸鹽形式，CAS NO：58-58-2，粉末形式，可溶于水配制成50 mg/ml儲存液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，-20℃凍存。真核細胞常用的篩選濃度為1-10μg /ml。

產(chǎn)品特性

1）化學(xué)名：3'-[α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3'-deoxy-N, N-dimethyladenosine dihydrochloride

2） 同義名：Stylomycin hydrochloride; CL 13900 dihydrochloride; P638 dihydrochloride; CL16536; NSC 3055;

3）CAS NO：58-58-2

4）分子式：C22H29N7O5·2HCl

5）分子量：544.43 g/mol

6）外觀(guān)：白色至灰白色粉末

7）純度：＞98% (HPLC)

8）熔點(diǎn)：175-177 °C

9）溶解性：溶于水（50mg/ml），乙醇（~1mg/ml），DMSO（~10mg/ml），PBS，pH 7.2（~10mg/ml）

保存條件: 

保存：-20℃干燥保存，4年有效。

產(chǎn)品使用：

1、儲存液制備

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的儲存液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，按照單次用量分裝，于-20℃凍存，避免反復凍融。也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的儲存液。

2、建議工作濃度

哺乳動(dòng)物細胞：1-10 μg/ml，最佳濃度使用宿主細胞殺滅實(shí)驗（殺滅曲線(xiàn)）來(lái)確定；

大腸桿菌：LB瓊脂培養基篩選敏感轉化菌株，使用濃度為100-125μg/ml。

【注意】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌陽(yáng)性轉化子不僅需精確的pH值調節，而且受宿主細胞本身狀態(tài)影響。

3、殺滅曲線(xiàn)的建立

嘌呤霉素合適的篩選濃度與細胞類(lèi)型、生長(cháng)狀態(tài)、細胞密度、代謝情況，以及細胞所處周期等因素有關(guān)。為了篩選到穩定表達的細胞株，確定殺死未轉染或感染細胞所需的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次實(shí)驗一定要建立殺滅曲線(xiàn)（kill curve），篩選到適合自身實(shí)驗體系的最優(yōu)篩選濃度。

1）于24孔板加入500 μl/孔制備好的細胞懸液，鋪足夠的孔以保證后續的梯度實(shí)驗。37℃細胞孵育過(guò)夜。理想情況開(kāi)始抗生素篩選時(shí)，細胞達到較高的密度（~60-80%），常用的細胞密度如下：

貼壁細胞：0.8 - 3.0 x 105cells/ml

懸浮細胞：2.5 - 5.0 x 105cells/ml

2）準備篩選培養基：含梯度濃度嘌呤霉素的新鮮培養基（比如，設置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，這11個(gè)篩選濃度，每個(gè)濃度2個(gè)復孔）；

3）將孵育過(guò)夜的細胞清洗后，更換新鮮制備的梯度篩選培養基；之后置于37℃，5%CO2培養箱內孵育；

4）根據細胞的生長(cháng)狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養基；

5）每日監測細胞，觀(guān)察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開(kāi)始4-6天內有效殺死非轉染或者所有非感染細胞的抗生素最低濃度，也就是將用到的最優(yōu)篩選濃度。

【注意】：如果發(fā)現細胞開(kāi)始變圓但沒(méi)有從平板表面脫落可能是以下情況，

a）變圓但是未脫落是細胞開(kāi)始死亡的一個(gè)信號，這些需要更長(cháng)的篩選時(shí)間；

b）若在建議濃度1-10μg/ml范圍內還不能完全處死細胞，此時(shí)需要檢測藥物是否有效，避免藥物的反復凍融（<5）。

注意事項：

1）嘌呤霉素為有毒化合物，操作時(shí)需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

2）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。