總一氧化氮（NO）檢測試劑盒（顯色法）

Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一種活性基，在許多關(guān)鍵生理功能中發(fā)揮重要作用。一氧化氮，一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸的氧化產(chǎn)物，參與宿主防御和發(fā)育、調節蛋白活化、以及與功能生物分子之間的直接共價(jià)相互作用。一氧化氮生成后迅速代謝生成亞硝酸鹽（Nitrite）和硝酸鹽（Nitrate），兩種首要的、穩定的和非揮發(fā)性的裂解產(chǎn)物，通過(guò)對這兩種產(chǎn)物的測定能間接反映樣本內的一氧化氮水平。

本總一氧化氮檢測試劑盒（Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用兩步法測定總一氧化氮水平，第一步先用硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，第二步再用經(jīng)典的Griess reagent，對亞硝酸鹽進(jìn)行定量測定，從而推算出總一氧化氮含量。

由于本試劑盒使用的是NADPH依賴(lài)的硝酸鹽還原酶，高濃度的NADPH會(huì )干擾后續檢測，因此，試劑盒使用乳酸脫氫酶（LDH）來(lái)清除NADPH，確保檢測結果的準確性。

本試劑盒以亞硝酸鈉為標準品，通過(guò)優(yōu)化的檢測體系，檢測下限達2μM，且在2~80μM范圍內具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。本試劑盒不僅能檢測細胞、組織或培養液中的一氧化氮含量，還能檢測血清、血漿或尿液中的一氧化氮含量。

保存條件: 

-20℃保存，一年穩定。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

【注意】本試劑盒可用于培養液中的一氧化氮測定，培養液內的酚紅和10%血清對測定無(wú)明顯干擾。

【注意】樣品中存在的一些內在成分可能會(huì )干擾測定，導致OD值和靈敏度降低。干擾程度依次順序：尿液>血清>血漿>培養基。

一、 需要設備

96孔酶標儀，最佳波長(cháng)540nm，或在520~560nm下測定，靈敏度可能會(huì )降低。

二、 準備步驟

2.1 標準品準備：

每次測量均新做標準曲線(xiàn)，用待測樣品所用溶液來(lái)稀釋標準品，使得濃度在2~80μM內。標準品的濃度通?？扇?span>2，5，10，20，40，60，80μM。

比如：當樣品為細胞培養液上清，細胞培養液為DMEM+10% FBS，則用DMEM+10% FBS稀釋標準品；當樣品為血清，可使用本試劑盒內提供的樣品稀釋液（NBS5940-A），或簡(jiǎn)單使用PBS、生理鹽水等適當溶液稀釋標準品；當樣品是用一氧化氮分析用裂解液得到的裂解液，則用此裂解液稀釋標準品。

2.2 樣品準備：

a）對于含高濃度蛋白的樣品如血清，或含高濃度血清的細胞培養液，加入Griess reagent I后可能產(chǎn)生沉淀，可取50μl樣品，加入50μl Griess reagent I進(jìn)行測試，觀(guān)察是否產(chǎn)生沉淀。如有沉淀，則把樣品沸水浴加熱5min以變性蛋白，之后12,000離心5min，取上清用于后續的測定。

b）當樣品為組織或細胞，可快速凍融裂解，然后離心沉淀取上清，體積不足50μl，可用雙蒸水、超純水或0.9% NaCl稀釋?zhuān)ㄏ鄳臉藴势芬残栌秒p蒸水、超純水或0.9% NaCl稀釋?zhuān)?。細胞或組織也可用一氧化氮分析用裂解液來(lái)裂解，同樣的，標準品需用此裂解液稀釋。

c）當樣品為尿液，通常需用水稀釋10~50倍后檢測。

d）當樣品為血漿，不宜用肝素抗凝的血漿，因其會(huì )和Griess reagent反應產(chǎn)生沉淀。

2.3 試劑準備

a）加1ml雙蒸水或超純水至5mg NADPH中，顛倒混勻使其充分溶解，之后再加3ml雙蒸水或超純水定容至3ml，配制成2mM NADPH，多余部分按照單次用量分裝，立即置于-70℃保存。

b）FAD第一次使用可適當分裝后放在-20℃或-70℃保存。

c）硝酸還原酶和LDH臨用前取出，放置在冰浴上使用，使用完畢后需立即放回-20℃保存。

d）試劑盒內的其余各種試劑溶解后保存在冰浴上。

e）Griess reagent I和Griess reagent II使用前需回溫至室溫。

三、測定步驟

3.1參考下表依次加入標準品、樣品和檢測試劑，并進(jìn)行相應檢測：

【注意事項】

a） 反應必須避光進(jìn)行。當使用96孔板進(jìn)行檢測，可用鋁箔紙包裹96孔板進(jìn)行避光。

b） 樣品的用量上限為60μl。血清、血漿或組織勻漿液通常使用40μl足夠。樣品不足60μl，不同樣品之間的體積需要保持一致，體積不足的部分用制備或稀釋樣品所用的溶液補足。

c） 可同時(shí)設置加入200μl水或PBS的2~3個(gè)孔為陰性對照，這2~3個(gè)孔僅加入水或PBS，不在加入任何其他試劑。

d） 加入Griess reagent I后需輕輕混勻。

e） 每次混勻后，可以1000~3000g離心數秒，把液體沉淀至管底。同時(shí)需避免各檢測孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測結果。

3.2 在540nm（或520~560nm）測定吸光度。需在30min內測完，以防褪色降低靈敏度。

3.3 以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)，獲得橫縱坐標之間的函數關(guān)系式。之后將樣品OD值代入公式來(lái)計總算一氧化氮濃度。

3.4 實(shí)際測定時(shí)，由于反應條件、試劑盒批次差異等因素，會(huì )導致檢測結果與示例數據存在一定差異。

注意事項：

1.      當檢測細胞或組織一氧化氮含量，不建議使用RIPA裂解液，因其可能在后續實(shí)驗中產(chǎn)生沉淀，影響測試。建議使用一氧化氮分析用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制劑）。也可自行選擇適當方式制備組織或細胞樣品的裂解液，要考慮到自行選擇的方式是否存在干擾試劑盒內酶反應的可能。

2.      當檢測細胞培養液內一氧化氮含量，不可使用RPMI1640等含較高濃度硝酸鹽的培養液，否則會(huì )干擾檢測。

3.      所有檢測反應需避光進(jìn)行。

4.      由于檢測過(guò)程存在還原反應，凡是影響還原反應的試劑都需要避免，比如DTT或2-ME。

5.      本試劑盒利用的是間接法測定總一氧化氮含量，如果只需粗略測定一氧化氮相對量，可選擇我司提供的一氧化氮檢測試劑盒（貨號：NBS5939-500T）。如果需要直接測定一氧化氮水平，比如測定細胞內實(shí)際的一氧化氮水平，可選擇我司提供的DAF-FM DA一氧化氮熒光探針（貨號：NBS5935-100T）。

6.      本試劑盒對人體有害，請注意適當防護，避免直接接觸人體或吸入體內。

7.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

常見(jiàn)問(wèn)題：

1. 檢測結果標準曲線(xiàn)良好，但樣品的吸光度很低，和空白對照接近，什么原因？

回復：標準曲線(xiàn)良好說(shuō)明檢測方法和檢測試劑盒基本上沒(méi)有問(wèn)題，樣品吸光度低說(shuō)明樣品中一氧化氮含量很低?？梢圆扇〉霓k法是：1）加大樣品和標準品的使用量至60μl，其余試劑用量不變。2）把整個(gè)檢測體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測靈敏度增加約50%。3）如果上述方法還不能解決問(wèn)題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時(shí)候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細胞時(shí)采用較小體積的裂解液），另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。

2. 檢測時(shí)發(fā)現每個(gè)樣品的吸光度都非常高，什么情況？

回復：使用RPMI 1640培養液時(shí)會(huì )發(fā)生這種情況。因RPMI 1640培養液中含有高濃度的硝酸鹽從而會(huì )使樣品檢測出來(lái)的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會(huì )產(chǎn)生類(lèi)似情況，影響氧化還原反應的試劑也可能產(chǎn)生類(lèi)似干擾。使用過(guò)程中避免使用RPMI 1640等可能導致干擾檢測的試劑即可。

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