DAF-FM DA 一氧化氮（NO）熒光探針（固體粉末）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

DAF-FM DA，也稱(chēng)為DAF-FM Diacetate，或4-Amino-5-Methylamino-2',7'

-Difluorofluorescein Diacetate，是新一代用于檢測和定量一氧化氮（Nitric oxide，NO）的熒光探針。具有細胞膜滲透性，無(wú)熒光。一旦進(jìn)入細胞后，被細胞內的酯酶催化形成不具有膜滲透性的DAF-FM。DAF-FM本身僅有弱熒光，但和NO反應后可產(chǎn)生強烈熒光，最大激發(fā)波長(cháng)為495nm，最大發(fā)射波長(cháng)為515nm。任何可以檢測熒光素的儀器都能檢測，包括流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光酶標板和熒光計。

    與傳統的NO熒光探針—DAF-2 DA相比，DAF-FM DA具有以下重要優(yōu)勢：a）DAF-FM-NO加合物的光譜特性在pH 5.5以上不受pH影響；b）DAF-FM-NO加合物具有更顯著(zhù)的光穩定性，意味其提供更多的時(shí)間來(lái)捕捉圖像；c）DAF-FM對NO的檢測靈敏度更高，前者的檢測下限~3nM；而DAF-2的檢測下限~5nM。

本品以固體粉末形式提供，需用無(wú)水的DMSO溶解，用合適的生理緩沖液或新鮮培養基（不含血清和酚紅）稀釋到相應的工作濃度即可，建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO.：254109-22-3

2） 化學(xué)名：3',6'-bis(acetyloxy)-4-amino-2',7'-difluoro-5-(methylamino)-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthen]-3-one

3） 英文同義名：DAF-FM Diacetate; 4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate; 3-Amino, 4- aminomethyl-2?,7?-difluorofluorescein Diacetate; Diaminofluorescein-FM diacetate;

4） 中文同義名：DAF-FM二乙酸鹽；二氨基熒光素-FM二乙酸鹽；4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟熒光素二乙酸鹽；3-氨基, 4-氨甲基-2?,7?-二氟熒光素二乙酸鹽；

5） 分子式：C25H18F2N2O7

6） 分子量：496.42

7） 純度：≥98%（HPLC）

8） 外觀(guān)：無(wú)色至淡黃色溶液

9） Ex/Em：~495/515 nm (DAF-FM)

10）化學(xué)結構圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、 工作液制備

取用50ug DAF-FM DA加入新鮮無(wú)水的DMSO 20.1442 μL溶解至濃度為5mM， 用合適的生理緩沖液或新鮮培養基（不含血清和酚紅）稀釋到相應的工作濃度即可，探針的推薦使用濃度為1-10μM，初次使用需根據自身實(shí)驗體系來(lái)進(jìn)行加載濃度。比如取5μl DAF-FM DA(5mM)按照1：1000的比例稀釋到5ml DAF-FM DA(5μM)工作液，充分混勻。

【注意】工作液必須現配現用，實(shí)驗結束后需丟棄多余探針。由于染料在水溶液中更容易氧化分解，為此，請盡快用完。

【注意】探針的最佳工作濃度需根據自身的細胞類(lèi)型或實(shí)驗條件來(lái)摸索，或參考文獻。一般情況下，在保證獲得足量熒光信號的前提下，盡量選擇最小濃度的探針，這樣可盡量減少酯的水解副產(chǎn)物如甲醛和乙酸的富集。

二、 探針裝載

對于刺激時(shí)間較短（通常為2h以?xún)龋┑募毎?，先裝載探針，后用適當的陽(yáng)性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時(shí)間較長(cháng)（通常為6h以上）的細胞，先用適當的陽(yáng)性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

2.1 探針原位裝載（僅適用于貼壁細胞）

a）去除細胞培養液，加入適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個(gè)孔加入工作液體積為1ml。

b）37℃孵育20min。

c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進(jìn)入細胞內的DAF-FM DA。

2.2 收集細胞后探針裝載

a）細胞收集后，用適當體積準備好的DAF-FM DA工作液（比如按1：1000倍稀釋后的工作液）重懸細胞，使得細胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升。

b）37℃孵育20min。以上操作可以在離心管內進(jìn)行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。c）用PBS, pH7.4洗滌細胞3次，以充分去除未進(jìn)入細胞內的DAF-FM DA。

d）直接用適當的陽(yáng)性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后再刺激細胞。

三、 熒光檢測

3.1對于原位裝載探針的樣品：可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察（用普通的熒光顯微鏡觀(guān)察效果相對較差），或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

3.2 對于收集細胞后裝載探針的樣品：可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察也可以。

3.3 參數設置：使用495nm激發(fā)波長(cháng)，515nm發(fā)射波長(cháng)，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強弱。DAF-FM-NO反應產(chǎn)物的熒光光譜和熒光素（Fluorescein）非常相似，可以用檢測熒光素的參數設置進(jìn)行檢測，用檢測FITC的參數設置進(jìn)行檢測也可以。

四、 其他說(shuō)明

4.1 上述步驟推薦DAF-FM DA的工作濃度為5μM。對于某些細胞，如果發(fā)現沒(méi)有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時(shí)DAF-FM DA的工作濃度為1-2.5μM。相反，如果發(fā)現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調整為10μM，以提高檢測的靈敏度。

4.2 探針裝載的時(shí)間可以根據情況在15-60min內適當進(jìn)行調整。

注意事項：

1.      DAF-FM DA在4℃、冰浴等較低溫度下會(huì )凝固而粘附在離心管管底、管壁或管蓋內，可在25℃溫育片刻直至完全溶解后再使用。

2.      第一次使用本品，請置于室溫或25℃溫育片刻直至完全溶解后，低速離心后，根據單次用量分成小包裝后-20℃避光干燥保存，避免反復凍融。

3.      BSA和酚紅對DAF-FM的熒光檢測有干擾，請避免體系內含有這些組分。

4.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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