Propidium Monoazide (PMA) 疊氮溴化丙錠

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）是一種光反應的DNA結合染料，用于微生物（比如：細菌、病毒和真菌）的活力PCR（v-PCR）分析。作為一種DNA修飾劑和光反應染料，PMA高親和結合DNA。經(jīng)可見(jiàn)光刺激發(fā)生光裂解后，PMA共價(jià)吸附到DNA上，這一改性的DNA不能被PCR擴增。PMA染料不具細胞膜滲透性，因此，在含活死細胞的群體內，只有死細胞對DNA修飾劑敏感，由于具受損的細胞膜。PMA染料的這一特性，使其高度適合通過(guò)qPCR的手段來(lái)選擇性檢測活細菌（見(jiàn)Fig 1. PMA的作用機理）。

Fig 1. PMA的作用機理示意圖。細胞膜非滲透性染料-PMA選擇性和共價(jià)修飾死細菌（具受損細胞膜）來(lái)源的DNA，而活細菌來(lái)源的DNA保持不變。由于PMA修飾的DNA不能擴增（這一產(chǎn)物抑制PCR聚合酶的擴增反應），因此，后續的qPCR能選擇性定量活細菌。

疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）具有以下特征：①利用qPCR技術(shù)選擇性檢測活細胞；②死細胞特異性染料，結合到DNA上；③光活化后共價(jià)交聯(lián)到DNA上；④適用于多種樣本類(lèi)型包括：細菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細胞；能應用在食品和水安全和環(huán)境測試，能與qPCR、NGS、Sanger測序和LAMP技術(shù)結合使用。

產(chǎn)品特性：

1） 分子量：511 g/mol
2） 外觀(guān)：深紅色固體
3） Abs：464nm（光裂解前）
4） Abs/Em：510/610nm（光激活后交聯(lián)到核酸上）
5） 溶解性：溶于DMSO、DMF、H₂O（20mM）

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

1. 活力PCR（v-PCR）實(shí)驗前考慮事項

1.1 活力PCR基于細胞膜滲透性來(lái)區分活細胞和無(wú)活力細胞。許多殺死細胞的方法都會(huì )引起受損細胞膜，從而適用于活力PCR分析。但是，某些方法比如紫外曝光，不會(huì )立即引起破損的細胞膜。文獻搜索和預實(shí)驗有助于確定活力PCR適用于您使用的細胞類(lèi)型和處死方法。

1.2 引物選擇是重要考慮因素。如果希望同時(shí)檢測混合物中的所有細菌類(lèi)型，靶向rRNA的引物（寬譜物種特異性）是很好的選擇。如果只想檢測某一種特定的細菌類(lèi)型，則需設計或查找特定的引物。染料分子是隨機結合DNA雙鏈。因此，擴增子越長(cháng)，染料結合到擴增子上的可能性越高。建議擴增子的長(cháng)度至少100bp，擴增子越長(cháng)通常得到更好的結果。

1.3 進(jìn)行活力PCR實(shí)驗前冰凍樣本，可能損傷細胞膜，并且給出錯誤的陰性結果。我們發(fā)現冰凍對革蘭氏陽(yáng)性菌的結果影響高于革蘭氏陰性菌。光照后樣本可進(jìn)行冰凍保存。

1.4 為了讓PMA共價(jià)結合到死細胞DNA上，活力PCR需先進(jìn)行光活化步驟?？梢杂盟{色或白色光源來(lái)刺激?？偟膩?lái)說(shuō)，光照越強，光活化步驟越有效。非LED光，比如：鹵素燈，可能會(huì )加熱樣品對測定產(chǎn)生負面影響。

1.5 PMA的作用方式有一部分是通過(guò)沉淀從樣本中去除PMA-結合的DNA，因此，不同樣品間每一個(gè)qPCR反應中模板DNA的量不需要歸一化。取而代之的是，使用每個(gè)樣本中洗出的等體積gDNA用于PCR反應。作為qPCR反應的陽(yáng)性對照，1ng 純化的gDNA足夠產(chǎn)生良好的信號。

1.6 為了確保待測樣本的PMA有效性，最好建立活細胞和死細胞對照，每個(gè)分別設置加和不加PMA組。每一組對照因PMA引起的Ct值變化（dCt）都需測定。

2. 儲存液制備

將低溫保存的PMA粉末置于室溫回溫至少20min，低速離心使粉末沉至管底。避光條件下加入98μl無(wú)菌水，充分溶解混勻，即得到20mM儲存液。儲存液根據單次用量分裝，-20℃避光凍存，至少6個(gè)月有效。

3. 活力PCR操作方法

以下是用PMA檢測細菌培養物的通用操作方法。建議首先對測試物種的活菌和死菌對照進(jìn)行對照實(shí)驗。對于復雜樣本，比如糞便或土壤，可能需優(yōu)化樣本稀釋、染料濃度和光處理時(shí)間。對于稀釋樣本，比如水樣，可能在PMA處理前需對樣本做過(guò)濾或濃縮處理。

3.1 用合適的培養基接種和擴增細菌（擴增體積依實(shí)驗用量設置）。過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間振蕩培養，直至培養懸液OD₆₀₀接近1。

3.2 （推薦）：為了制備死菌對照樣本，于90℃處理5min使得細菌熱失活。如果想比較活力PCR與平板培養菌活，可以在適宜的培養基平板上涂布10μl熱失活的細菌，以及涂布10μl（1：100倍未處理的細菌）于另一平板上。適當條件下培養觀(guān)察菌落生長(cháng)情況。

3.3 取400μl細菌培養物到一干凈的離心管。每一個(gè)樣本，需設置一管PMA處理菌，和一管非PMA處理菌（不加染料），為了計算dCt值。

3.4 室溫避光下取適量的PMA儲存液到管內使其終濃度為50μM（比如：1μl 20mM儲存液加入400μl菌液）

3.5 室溫避光孵育10min，孵育期間可以適當指撥混勻，也可用鋁箔紙包好置于搖床上孵育。

3.6 將樣品曝光， 可以使用藍色或白色光源， 不同的光源照射時(shí)間需自行摸索，使PMA與DNA充分交聯(lián)。例如：可用60W的藍光燈，照射15min。通常，光線(xiàn)越亮，效率越高。非LED光，比如：鹵素燈，可能會(huì )加熱樣品對測定產(chǎn)生負面影響。

3.7 5000g，離心10min。

3.8 使用標準方法或商業(yè)化的試劑盒抽提基因組DNA，用于后續的qPCR實(shí)驗。

3.9 選擇特異性的引物來(lái)執行qPCR（關(guān)于引物選擇，每一個(gè)PCR反應確保使用相同體積的洗脫DNA）。經(jīng)PMA修飾的DNA會(huì )在qPCR反應中表現出擴增延遲效應。

注意事項：

1.      熒光探針均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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