Cal-590 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶(hù)，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

鈣離子測定在各種生理活動(dòng)中發(fā)揮著(zhù)重要作用，與鈣離子結合從而表現出光譜反應的熒光探針使得研究人員能夠觀(guān)察胞內游離鈣離子水平變化，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光光度計和熒光酶標板來(lái)檢測。
新一代鈣離子熒光探針：Cal-520，Cal-590和Cal-630是最強大且均一的細胞內鈣流（Calcium mobilization）測定用熒光探針，與傳統的鈣離子探針（比如：Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細胞內滯留性。
Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM具有細胞膜滲透性，能夠預加載進(jìn)入細胞。一旦進(jìn)入細胞候，親脂阻斷基團AM被酯酶裂解，產(chǎn)生帶負電荷的熒光染料，留在細胞內部。一旦與鈣離子結合后，它們的熒光顯著(zhù)加強。當細胞被激動(dòng)劑刺激后，受體發(fā)出細胞內鈣釋放的信號，從而使得Cal-520，Cal-590和Cal-630的熒光增加。Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM的高靈敏度以及>100倍的熒光增強使其成為胞內鈣離子測定的理想探針。高信噪比和更加的胞內滯留性使其成為評估GPCR和鈣離子通道靶標以及篩選對應激動(dòng)劑和拮抗劑的優(yōu)秀工具。

Cal-520，Cal-590和Cal-630基本定位在細胞質(zhì)，不像Rhod-2主要定位在線(xiàn)粒體。Cal-590和Cal-630的長(cháng)激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)使其為完美的鈣離子探針，能夠與綠色熒光蛋白（GFP）標記細胞兼容多色檢測。另外，Cal-520，Cal-590和Cal-630也與絕大多數現存的熒光儀器兼容。Cal-520在488nm處被良好激發(fā)，用FITC濾片檢測；Cal-590經(jīng)優(yōu)化在555nm處被良好激發(fā)，用TRITC/Cy3濾片檢測；Cal-630經(jīng)優(yōu)化在594nm處被良好激發(fā)，用Texas Red濾片檢測；

產(chǎn)品特性：

1）同義名：Cal-590, Acetoxymethyl Ester;

2）分子量：分子量：1266.81

3）解離常數：K_d=561 nM

4）溶解性：DMSO

5）Ex/Em：574/588

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱(chēng)取100mg  Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無(wú)水DMSO溶解Cal-590 AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Cal-590 AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Cal-590 AM中加入9.8μl 無(wú)水DMSO）。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將Cal-590 AM+DMSO儲存液稀釋到含0.04% Pluronic F-127的10-20μM染色工作液。

【注①】：添加一定量的20% Pluronic F-127溶液到Cal-590 AM+DMSO儲存液，使Pluronic F-127的濃度約為0.04%。Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲存液長(cháng)期保存。

【注②】：Cal-590 AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注③】：Cal-590 AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3） 【可選】如果細胞內（比如CHO細胞）含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2mM）可能需要加入上述染色工作液內（在孔內的最終濃度為0.5-1mM），以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：我司提供多種丙磺舒：包括水溶性的丙磺舒（NBS2008-154MG），能降低有機溶劑的使用。

4） 加入等體積的染色工作液到細胞培養孔內，37℃孵育60-90min。然后，室溫再孵育30min。

【注①】：某些細胞系探針的加載時(shí)間長(cháng)于2h能提供更好的信號。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 之后在HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）中，用合適的激發(fā)/發(fā)射波長(cháng)來(lái)檢測熒光（見(jiàn)產(chǎn)品特性：Cal-590 AM的激發(fā)和發(fā)射光譜）。

【注①】：對于熒光顯微鏡檢測，建議用TRITC/Cy3濾片來(lái)檢測，建議用黑框/透明底的細胞培養板。

【注②】：對于熒光酶標儀檢測，建議用激發(fā)波長(cháng)：540nm，發(fā)射波長(cháng)590nm，cut-off波長(cháng)570nm來(lái)檢測，建議用黑框/透明底的96孔板；

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底

3.      Cal-590, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì )凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Cal-590, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗效果，盡量在短時(shí)間內使用

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

附錄I Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣離子探針的波長(cháng)和鈣離子結合特性