FerroFarRed (Fe2+ indicator) 亞鐵離子熒光探針

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

FerroFarRed，也稱(chēng)為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一種特異性檢測不穩定的鐵(II)離子（Fe²⁺）的熒光探針。FerroFarRed基本無(wú)熒光，一旦與Fe²⁺反應后，不可逆的生成一種遠紅熒光產(chǎn)物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，圖1. FerroFarRed的光譜特征）。生理濃度下的鐵（III）離子（Fe³⁺）或其它除鐵離子以外的二價(jià)金屬離子都不會(huì )使其熒光增強（見(jiàn)圖2. FerroFarRed的金屬離子反應特異性）。FerroFarRed具細胞膜滲透性和高選擇性，且在高達100μM的濃度下對細胞幾乎無(wú)毒性，適用于活細胞內Fe²⁺的檢測，傾向定位在內質(zhì)網(wǎng)（ER）。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀以及流式細胞儀（配置紅色激光器）分析。

圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。FerroFarRed的最大吸收波長(cháng)在646nm，而最大熒光波長(cháng)在662nm。

圖2.FerroFarRed的金屬離子反應特異性。FerroFarRed（5 μM）與各種金屬離子反應后，用熒光酶標儀測定熒光強度（激發(fā)波長(cháng)：630nm，發(fā)射波長(cháng)665nm）?？梢?jiàn)，僅與Fe2+反應后發(fā)生顯著(zhù)的熒光增強。

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、 需要自行準備的材料

1.1 細胞培養級或超純DMSO【強烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能會(huì )增加FerroFarRed的背景信號】

1.2 合適的觀(guān)察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚紅。

1.3    無(wú)血清細胞培養基（D-MEM等）

二、探針準備

2.1從冰箱取出FerroFarRed，置于室溫回溫至少30min，將其置于微量離心機內低速離心。將瓶?jì)鹊姆勰╇x心到管底后，再開(kāi)蓋。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）內加入50μl 高質(zhì)量DMSO，用槍反復吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mM FerroFarRed儲存液?！咀⒁猓?span>FerroFarRed是藍色固體，但溶液幾乎無(wú)色（淺藍色）】。建議單次用完儲存液，若實(shí)在用不完，請根據單次用量分裝，置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來(lái)稀釋儲存液。

三、HeLa細胞Fe²⁺的染色步驟（熒光成像分析）

3.1 在玻底培養皿內接種細胞，培養過(guò)夜。

3.2從培養皿內吸走培養基，用合適的觀(guān)察緩沖液（比如：HBSS）清洗兩次。

3.3 用無(wú)血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

3.4 將染色工作液加入培養皿內，于37℃孵育1h。

【注意：①建議根據細胞類(lèi)型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間。②如果細胞很容易從培養皿上脫落，建議使用多聚L-賴(lài)氨酸或其它包被基質(zhì)包被的培養皿來(lái)接種細胞?！?/span>

3.5 染色后用觀(guān)察緩沖液（比如：HBSS）清洗一次，替換成新的觀(guān)察緩沖液。

3.6 在熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞。

四、HepG2細胞Fe²⁺的測定（流式分析）

4.1 于多孔培養板內接種細胞，過(guò)夜培養。

4.2 從培養板內吸走培養基，用合適的觀(guān)察緩沖液（比如：HBSS）輕輕的清洗兩次。

4.3 用無(wú)血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

4.4 將染色工作液加入培養板內，于37℃孵育1h。

【注意：建議根據細胞類(lèi)型和自身實(shí)際需求優(yōu)化工作濃度和孵育時(shí)間?！?/span>

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% 胰酶-EDTA消化細胞。

4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% 胰酶-EDTA，之后500 x g離心細胞懸液5min，以沉淀細胞。

【注意：不可用血清來(lái)中和胰酶?！?/span>

4.7 吸走上清，用PBS重懸細胞。

4.8 用細胞篩網(wǎng)（40μm尼龍篩網(wǎng)）過(guò)濾細胞，去除細胞碎片。

4.9 上機，流式細胞儀分析。

五、熒光檢測

對于激光激發(fā)：635nm波長(cháng)左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀(guān)察。

對于熒光顯微鏡觀(guān)察：選擇檢測Cy5的紅色激發(fā)濾片。對于流式分析，選擇檢測APC的濾片。

注意事項：

1.      FerroFarRed傾向定位在內質(zhì)網(wǎng)，但也可能檢測細胞質(zhì)池內的Fe²⁺，目前針對這一點(diǎn)未做明確評估。

2.       熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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