Western Blot蛋白免疫印跡(WB)快速實(shí)驗攻略

WB即Western Blot，蛋白質(zhì)免疫印跡。是一種基于抗原抗體的特異性結合，半定量檢測樣品中某種蛋白的技術(shù)。作為分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種經(jīng)典實(shí)驗方法，WB雖看似??簡(jiǎn)單，卻常因各種因素做不出好看的結果圖，甚至拿不到結果。今天帶領(lǐng)大家從頭開(kāi)始，一整個(gè)過(guò)一遍超詳細的實(shí)驗流程，保管你一學(xué)就會(huì )，結果圖好看的讓人敬佩！

完整的WB流程，如下圖所示，包含樣本制備、SDS-PAGE、轉膜、抗體結合、蛋白檢測5個(gè)大步驟。

樣品制備

01蛋白提?。ㄒ訰IPA裂解液為例）

1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF（Cat# NBS0101），使PMSF的最終濃度為1 mM。

2）貼壁細胞：去除培養液，用PBS（Cat# NBS3021）、生理鹽水或無(wú)血清培養液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。細胞充分裂解后應沒(méi)有明顯的細胞沉淀。

• 懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒(méi)有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必須分裝成0.5-1×106個(gè)細胞/管，然后再裂解。

• 組織樣本：按照每20mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。??

3）充分裂解后，10000-14000 g離心3-5 min，取上清，即可進(jìn)行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì )出現一小團透明膠狀物，屬正?，F象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續實(shí)驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#NBS5216）打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實(shí)驗。如果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。

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02蛋白定量

1）配制BSA標準品體系

標準品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進(jìn)行稀釋?zhuān)渲贸商荻葷舛鹊臉藴势??；蛘吣梢赃x購BCA蛋白濃度測定試劑盒（Cat# BK0001）直接使用。

 2）取25 μL標準品或待測樣品加入到微孔板中。

3）每孔加入200 μL BCA工作液，振蕩30 s充分混勻。蓋上微孔板，37℃孵育30 min。

4）冷卻到室溫，在酶標儀上的540-595 nm波長(cháng)范圍處檢測吸光度，其中562 nm波長(cháng)為最佳。

5）根據BSA標準品的吸光度（減去標準品中空白孔的OD值即最終的讀數），繪制標準曲線(xiàn)（X-蛋白濃度ug/mL；Y-最終的OD562 nm）。依據標準曲線(xiàn)和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。

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SDS-PAGE電泳

電泳凝膠可選擇SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、預制膠（Bis-Tris體系）三種。

以預制膠操作為例：

1）剪開(kāi)包裝取出預制膠，撕去膠板底端深綠色膠帶，緩慢地拔出梳子，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿(mǎn)電泳緩沖液，外槽液體加入量要高于電泳槽高度1/3?？捎靡埔簶尰蚱渌ぞ呶‰娪揪彌_液輕輕吹打加樣孔，去除加樣孔內殘留的儲存緩沖液和雜質(zhì)。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液（Cat# NBS1047）。水浴溶解后立即室溫存放。

3）按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱 3-5 min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）在每個(gè)樣品孔中上樣10-30 μg蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，推薦150 V，跑50-70 min，通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳結束，取出凝膠，使用起膠器或其他合適的工具插入到膠板兩側之間的空隙中，慢慢的上下撬動(dòng)上、中、下三個(gè)不同的位置，然后在另一側重復操作，直至膠板兩側完全打開(kāi)。

7）膠板打開(kāi)后，凝膠可能粘在膠板的任意一側，將有凝膠一側的膠板傾斜至水中，輕輕撥動(dòng)凝膠，使凝膠自由掉落到裝有水的器皿中，晃動(dòng)清洗凝膠，然后取出進(jìn)行后續轉膜實(shí)驗。

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轉膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5 min。（如果檢測小分子蛋白質(zhì)，可省略該步驟，因小分子蛋白容易擴散）。

2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10 min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2 min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。（膜的選擇：0.45 μm孔徑，用于一般蛋白；0.22 μm孔徑，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用滾輪或試管趕盡氣泡。

4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入Fast Transfer Buffer(20X) 快速轉印緩沖液（20X）（Cat# BR0003-01）中350 mA， 40 min完成轉膜。

5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5 mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10 min或更長(cháng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。注：如果沒(méi)有出現染色條帶，則表示轉膜失敗，可能需要重新轉膜或重新上樣電泳。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清??晰后???拍照，大概沖洗2~3次，每次5 min。???

8）脫色：將膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用TBST（Cat# NBS7510）清洗膜2~3次，每次5 min。

10）將膜置于10~20 mL快速無(wú)蛋白封閉液（Cat# BR0051-01）中，在室溫振蕩孵育30 min完成封閉。 

11）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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抗體孵育

1）將膜和一抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10 mL一抗稀釋緩沖液中在4oC下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min以去除殘留的一抗。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10 mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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蛋白檢測

1）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

2）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液（125 μL發(fā)光工作液/cm²膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3 min，準備立即壓片曝光。

3）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

4）在X光膠片暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來(lái)完全包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白帶面向上。

5）暗房?jì)葔篨光膠片，分別曝光不同的時(shí)間，如數秒到數分鐘。顯影沖洗。（從剛開(kāi)始的10 s曝光時(shí)間中可以看出適當的曝光時(shí)間。由于檢測反應的動(dòng)力學(xué)特征，在孵育后信號立即變得最強，但在隨后的2小時(shí)內會(huì )減弱）

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