FITC Phalloidin FITC  標記鬼筆環(huán)肽

【溫馨提示】：見(jiàn)我司整理的鬼筆環(huán)肽及偶聯(lián)物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產(chǎn)品專(zhuān)題。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱(chēng)鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結合肌動(dòng)蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動(dòng)蛋白），不會(huì )結合單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）。不像肌動(dòng)蛋白抗體，同時(shí)識別單體和聚合形式的肌動(dòng)蛋白。

鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計量比結合。不像肌動(dòng)蛋白抗體，對不同物種或來(lái)源的肌動(dòng)蛋白親和力會(huì )發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結合幾乎可忽略，染色和未染色區域的差異極其明顯。

鬼筆環(huán)肽使得肌動(dòng)蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強劑。另外，產(chǎn)生的復合物高度穩定（解離常數約3×10–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實(shí)用和方便的探針，對組織切片、細胞培養物或無(wú)細胞體系內的F-actin進(jìn)行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標記后的F-actin仍維持許多標記前的功能。比如，標記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標記的肌動(dòng)蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動(dòng)。

本品為FITC熒光標記的鬼筆環(huán)肽（FITC-Phalloidin），以溶于DMSO的儲存液形式提供，按照100μl/孔（96孔板），總共可做300次。

產(chǎn)品應用

1） 對固定的組織切片和組織細胞培養物進(jìn)行肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）的熒光染色；

2） 體外制備穩定的熒光肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）；

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，2年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來(lái)染色組織細胞培養物內的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實(shí)驗自身需求來(lái)選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、 實(shí)驗材料準備

1.1 FITC Phalloidin（Cat# NBS5830）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細胞培養級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、 染色工作液準備

2.1于實(shí)驗前，將低溫保存的FITC-Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開(kāi)瓶。第一次使用請將本品按照單次用量進(jìn)行分裝，置于-20℃密封避光干燥保存，一年穩定。

2.2本品以1000×DMSO儲存液形式提供。開(kāi)始實(shí)驗前，使用含1% BSA的1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如：1μl儲存液加入1ml含1% BSA的PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來(lái)計算，準備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進(jìn)行染色，但需調整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時(shí)間取決于特定的應用（初次實(shí)驗，可在1:1000~1:2000的稀釋倍數范圍內進(jìn)行濃度優(yōu)化）。根據特定的細胞類(lèi)型和/或細胞/組織對探針的通透性來(lái)調整合適的染色條件。

【注③】：建議使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。若無(wú)現成的BSA，可替代使用1×PBS Buffer（pH 7.4），以能得到理想結果為宜。

【注④】：染色工作液現配現用，室溫避光保存。

三、 染色流程（以96孔板為例）

3.1用黑框/透明底的96孔板進(jìn)行細胞培養，使其貼壁生長(cháng)達到70-80%的匯合度。

3.2吸掉培養液，用37℃預熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min?！咀⒁狻浚汗潭ㄟ^(guò)程中甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無(wú)甲醇的甲醛。

3.4用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5【可選】用破膜緩沖液透化細胞以提高染料的滲透性，室溫處理5min。

3.6用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現配的FITC-Phallodin染色工作液到每個(gè)孔內，完全覆蓋細胞，室溫避光孵育20-90min。

【注意】：通常情況4℃-37℃都適合用于染色。

3.8用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9【可選】加入100μl 即用型DAPI染色液或其他不同于FITC熒光光譜的細胞核染色液對細胞核復染，室溫約5min?！咀⒁狻浚杭毎藦腿緯r(shí)間可自行調整；細胞核復染也可以放到步驟3.7中進(jìn)行。

3.10用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.11【可選】加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）到孔內保護熒光。

3.12 熒光顯微鏡下觀(guān)察染色結果，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=492/518nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時(shí)請注意防護。

3.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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