Dispase II (neutral protease, grade II)

分散酶（中性蛋白酶）

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

中性蛋白酶（Neutral protease），商業(yè)名稱(chēng)Dispase II，也稱(chēng)分散酶II，普遍用于不同組織和器官中的細胞分離。Dispase II是一種非特異性金屬蛋白酶，能快速有效且溫和的破壞組織細胞外基質(zhì)釋放單細胞培養物（原代細胞培養物）或收集已培養的細胞將其轉移到新的培養基質(zhì)上（傳代培養）。另外，還能預防懸浮細胞培養過(guò)程中發(fā)生的成團現象。Dispase II極其穩定，不會(huì )受溫度、pH和血清內容物的干擾；通過(guò)螯合劑或稀釋很容易失活；酶活溫和，對細胞損傷小，可良好維持細胞膜完整性。

本品來(lái)源于多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa），無(wú)支原體或其他動(dòng)物病毒污染。以非無(wú)菌的凍干粉形式提供，比活力≥0.8 U/mg蛋白，使用前需進(jìn)行除菌。常用工作濃度范圍為0.6-2.4 U/ml。

產(chǎn)品特性:

1） EC NO：3.4.24.4

2） 同義名：Neutral protease中性蛋白酶

3） 比活力：≥0.8 U/mg protein (37℃, casein as substrate, pH 7.5)

4） 酶活力單位定義：在37℃，pH 7.5的反應條件下，1min內釋放福林酚陽(yáng)性反應氨基酸和多肽量相當于1 μmol (181 μg)酪氨酸所需的酶量即為一個(gè)活力單位。

5） 最佳pH：6.0 - 8.5

6） 激活劑：最佳Ca2+為2mM，該酶已含足量Ca2+確保最佳酶活力。

7） 抑制劑： EDTA, EGTA, Hg2+,以及其他重金屬。該酶活性不受血清干擾。

保存條件: 

2-8℃干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

一、儲存液和工作液制備

1）儲存液制備：用Hepe緩沖鹽溶液（50 mM Hepes/KOH pH7.4, 150 mM NaCl）溶解Dispase II凍干粉，配制成10mg/ml的儲存液，用0.22μM濾膜過(guò)濾除菌。本儲存液置于2-8℃，2周穩定；根據單次用量分裝凍存，高達2個(gè)月穩定，避免反復凍融。

2）工作液制備：使用時(shí)用合適的細胞培養液將儲存液稀釋到工作液濃度即可，常用工作濃度為0.6-2.4 U/ml。不推薦使用>2.4 U/ml的工作濃度。具體使用濃度請根據自身實(shí)驗體系或參考文獻來(lái)調整。

二、組織分離

1）用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm小片，之后用無(wú)菌PBS緩沖液清洗組織片幾次；

2）用Dispase II工作液（0.6-2.4 U/ml）浸沒(méi)并37℃孵育進(jìn)行組織解離；

3）置于水平搖床上，低速轉動(dòng)，37℃孵育直至組織完全解離；【注意】：第一次使用Dispase II，通過(guò)細胞計數來(lái)確定總反應時(shí)間。對于堅硬致密組織需要1h的孵育時(shí)間，不過(guò)孵育時(shí)間幾小時(shí)也不會(huì )有副作用。

4）若有需要，將消化產(chǎn)物用無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)過(guò)篩，從而分離解散細胞和殘留組織，或當更大片段組織靜置到管底，輕輕倒出上層細胞。若需要進(jìn)一步解離，則加入新鮮的Dispase II工作液到殘留組織。

5）低速離心收集細胞，吸掉酶工作液；

6）用適當的細胞培養液重懸細胞，置于正常預優(yōu)化條件下培養。

三、細胞亞培養

1）用37℃預熱的Dispase II工作液完全覆蓋細胞，置于37℃孵育5min；

2）吸掉溶液，于37℃再孵育10min；

3）顯微鏡觀(guān)察以確定消化情況，若有需要，可再孵育15min；

4）用細胞培養液重懸細胞，低速離心并用培養基清洗細胞幾次；

5）用新鮮細胞培養液重懸細胞；

6）按照常規方法進(jìn)行分盤(pán)傳代。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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