SYBR Green qPCR Mix（with Rox）

產(chǎn)品中心 > 分子生物學(xué) > SYBR Green qPCR Mix（with Rox）

SYBR Green qPCR Mix（with Rox）

貨號：P2091a（1ml）, P2092a（1mlx5） ,P2093a(1mlx10)
品牌：東盛

價(jià)格：￥400.00~3420.00

分享到：

貨號：

P2091a P2092a P2093a

產(chǎn)品詳細

SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR預混液，使用時(shí)只需加入模板和引物即可進(jìn)行反應。采用創(chuàng )新的熱啟動(dòng)機制可以減少引物二聚體和其他次級產(chǎn)物對反應的干擾，可以顯著(zhù)提高定量PCR的特異性、擴增效率，得到更廣的可定量擴增區域。采用了新的增強劑，對各種目的片段 PCR 效率的波動(dòng)可控制在最小范圍內，反復凍融對擴增性能影響極小。本品配有進(jìn)口參比染料ROX，適用于需要ROX校正的定量PCR機型，如ABI等。

產(chǎn)品組成

Component	P2091a	P2092a	P2093a
2X SYBR? Green qPCR Mixa	1 ml	1 ml × 5	1 ml × 10
100X ROX Reference Dye*	40 μl	200 μl	400 μl
超純水	1 ml	1 ml × 5	-

a 包含SYBR? Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反應緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應體系的2%，請根據需要調整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長(cháng)期保存。

質(zhì)量控制

純度檢測：經(jīng)質(zhì)量檢測，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：經(jīng)不同來(lái)源的模板和引物檢測，產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

Component	Volume		Final concentration
DNA template[1]	0.5-2 μl	1-4 μl	Variable
Forward primer (10 μM)[2]	0.2 μl	0.4 μl	0.2 μM
Reverse primer (10 μM)	0.2 μl	0.4 μl	0.2 μM
2X SYBR? Green qPCR Mix[3]	5 μl	10 μl	1X
100X ROX Reference Dye[4]	Variable	Variable	Variable
ddH2O	Variable	Variable	-
Total volume[5]	10 μl	20 μl	-

[1] DNA模板建議用量（10-20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過(guò)小，以免造成較大的誤差，但是cDNA的量不宜超過(guò)總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.2-0.6 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線(xiàn)出現雜峰，可以減少Mix用量至8 μl（20 μl體系）；如果對痕量模板的檢出率較低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl體系）。

[4] 對于某些固定型號的儀器，需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會(huì )給熔解曲線(xiàn)分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX的雜峰背景干擾，在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項，然后再進(jìn)行數據的收集與分析。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說(shuō)明，下表僅供參考。

Instruments	ROX (100X)
ABI PRISM 7000/ PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700	1-2% (High ROX)
ABI 7500/ 7500 Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/ Mx4000	0.2% (Low ROX)
Bio-Rad CFX96/ CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96; Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler	No ROX

[5] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說(shuō)明。

2. 設定反應程序進(jìn)行qPCR反應

注：本品含有熱啟動(dòng)酶，在60℃時(shí)會(huì )抑制酶活性，因此不建議使用兩步法，推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。

經(jīng)典三步法程序示例如下：

Stage	Temperature	Time	Cycle
Initial denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	15 sec	40
Annealing	55-65℃[1]	15 sec
Extension	72℃	20 sec
Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]

本品可用極速三步法快速完成反應，程序示例如下：

Stage	Temperature	Time	Cycle
Initial denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	5 sec	40
Annealing	55-65℃[1]	5 sec
Extension	72℃	5-10 sec[2]
Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。

[2] 150 bp以?xún)鹊臄U增子可設置為5 sec；150-300 bp的擴增子可設置為10 sec；300 bp以上的擴增子可適當延長(cháng)時(shí)間。

[3] 不同儀器熔解曲線(xiàn)采集程序不同，一般按儀器默認熔解曲線(xiàn)采集程序即可?？稍谘由欤ㄈ椒ǎ┗蛲嘶鹧由欤▋刹椒ǎ╇A段采集信號，也可在反應結束后72 hrs之內采集（避光低溫保存）。

3. 分析結果

觀(guān)察擴增曲線(xiàn)；調整基線(xiàn)，計算Ct值；觀(guān)察熔解曲線(xiàn)檢測特異性；進(jìn)行相對或絕對定量。

注意事項

? 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將（n+x）份反應液混勻后再分注到n個(gè)單管中，可降低加樣誤差。（n為重復次數，x為損耗量，一般為n的1/10）

? ABI的定量?jì)x器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量?jì)x器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說(shuō)明。

? 輕輕混勻反應液，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì )干擾熒光檢測?？伤矔r(shí)離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實(shí)驗結果的重要因素。務(wù)必設計特異性好的引物，隨實(shí)驗結果適當調整引物用量（0.05-0.9 μM）——特異性較差時(shí)減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴增效率較低時(shí)增加引物用量。

? DNA模板的量應小于500 ng/反應，過(guò)高的模板量會(huì )引起非特異性擴增。應根據模板類(lèi)型與基因表達量適當調整用量。

? 熔解曲線(xiàn)的采集不是必須的，初次使用的引物建議進(jìn)行熔解曲線(xiàn)采集。熔解曲線(xiàn)可以看出產(chǎn)物的特異性。產(chǎn)物特異性不好的原因有：引物特異性低；退火溫度設置偏低；引物/模板濃度偏高；等。同時(shí)，建議通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的特異性。