TRIzol Reagent 總RNA抽提試劑

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

TRIzol Reagent是一種即用型且操作迅捷的總RNA抽提試劑，適用樣本廣泛，包括人、動(dòng)物、植物、酵母或細菌來(lái)源的細胞和組織樣本。TRIzol Reagent是一種含酚、異硫氰酸胍和其他專(zhuān)利成分的單相溶液，有利于抽提分子量大小不一的各種RNA類(lèi)型。TRIzol Reagent能夠良好的維持RNA完整性，因能高效抑制樣本勻漿過(guò)程中細胞破損和細胞組分溶解時(shí)釋放的RNase活性。TRIzol Reagent能夠同時(shí)處理大量樣本，且以?xún)?yōu)化的方式一步法提取RNA，整個(gè)過(guò)程可在一小時(shí)內完成。

TRIzol Reagent分離的總RNA無(wú)蛋白質(zhì)和DNA污染，適用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等下游實(shí)驗。

保存與運輸方法

保存：2-8℃保存，至少一年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   所有離心管、槍頭以及相關(guān)溶液都必須無(wú)RNase污染。對于塑料制品、玻璃和金屬器皿、實(shí)驗儀器等可使用固相RNase清除劑去除RNase，或者用含0.01% DEPC的去離子水浸泡過(guò)夜，之后高壓滅菌、烘干。對于實(shí)驗溶液可使用液相RNase清除劑來(lái)處理或用DEPC處理水來(lái)配制。

2）   對新鮮組織或細胞樣本的抽提效果通常優(yōu)于凍存的組織或細胞，由于組織或細胞凍融過(guò)程中可能存在一些RNase釋放出來(lái)并酶切樣品。若是不能及時(shí)抽提RNA，推薦先加入適量TRIzol Reagent，之后裂解樣品后再凍存。

3）   TRIzol Reagent含有毒物質(zhì)，請在操作過(guò)程中注意好防護工作，戴好手套和護眼罩，避免皮膚接觸。在通風(fēng)櫥內完成操作，避免呼吸道吸入。

4）  為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.  需要自行準備的材料

水浴鍋或微量恒溫儀

異丙醇

75%乙醇

含0.5% SDS的RNase-free水或RNase-free水或DEPC處理水

【可選】RNase-free的糖原（核酸助沉劑）

2.  樣本要求

【重要】：樣本收集后立即進(jìn)行RNA分離，或樣本收集后立即凍存樣本并保存在-80℃或液氮中直至RNA抽提。

3. 樣本準備與分相

3.1 根據起始材料用TRIzol Reagent裂解和勻漿樣本。

◇組織樣本

按比例每50~100mg 組織加1ml TRIzol Reagent，之后用合適的方法進(jìn)行勻漿。通常用50~100mg組織即可獲得足量的RNA，滿(mǎn)足絕大多數下游實(shí)驗。加入過(guò)量組織或過(guò)少TRIzol都容易導致RNA提取失敗。

a）對于研缽研磨：將液氮凍存組織，放到研缽中研磨成粉末，之后加入1ml TRIzol，繼續研磨至組織完全裂解【研磨要迅速，最好不要超過(guò)1min】。b）對于玻璃勻漿器勻漿：加入1ml TRIzol上下手動(dòng)勻漿組織10~15次。c）對于機械勻漿器：將組織放入塑料管內，將塑料管置于冰浴燒杯內，加入1ml TRIzol，將分散器頭垂直插入管內與組織直接接觸，設置轉速12,000~20,000 rpm，上下移動(dòng)試管10~20次，直至組織完全打散，無(wú)明顯可見(jiàn)大塊即可。

◇單層生長(cháng)的細胞

吸盡培養基，之后往35mm培養皿（10cm2）內加入1ml TRIzol Reagent，晃動(dòng)3~5次，再用移液槍上下吹打3~5次，使其充分裂解?！景凑?0cm2培養面積加入1ml TRIzol加量。比如：六孔板每孔加入1ml TRIzol，12孔板每孔加0.5ml TRIzol】

◇  懸浮生長(cháng)的細胞

離心收集細胞，吸盡上清，每5-10×106個(gè)細胞（動(dòng)植物或酵母來(lái)源）或1×107個(gè)細胞（細菌來(lái)源）加入1ml TRIzol Reagent【加入TRIzol前不要清洗細胞，否則會(huì )增加mRNA降解的可能性】。用槍吹打幾次或適當渦旋，使其充分裂解。某些酵母和細菌如裂解不充分，可用勻漿器勻漿，使其完全裂解。

【注意】：樣本體積不要超過(guò)加入TRIzol體積的10%。

3.2 特殊樣本處理【可選】：對于某些富含蛋白，多糖或脂肪的樣本，經(jīng)TRIzol Reagent裂解后可能會(huì )有不溶物或油脂狀漂浮物出現。此時(shí)需12,000g 4℃離心10min，之后吸取澄清的上清液至一新的離心管中。

3.3 室溫孵育5min，使得核蛋白體完全分解。

3.4 按照每1ml TRIzol Reagent加入0.2ml 氯仿，蓋緊蓋子。渦旋混勻或用手劇烈晃動(dòng)15s，室溫孵育2~3min。

3.5 于12,000g 4℃離心15min。離心后混合物分為三層：下層酚-氯仿層，中間層，和上層無(wú)色的水相層。RNA無(wú)一例外的停留在水相層中。水相層的容量約為所加TRIzol Reagent體積的60%。用槍吸取上層無(wú)色水相到一新的離心管中，避免吸到任何中間層或下層成分。

【注意】：如果希望分離DNA和蛋白，請保留中間層和有機層。

4.      RNA分離

4.1    RNA的沉淀：a）【可選】如果起始樣本量比較少（＜106個(gè)細胞或＜10mg組織），加入5-10μg RNase-free的糖原作為核酸助沉劑到水相中。b）按每ml起初TRIzol Reagent加入0.5ml異丙醇，顛倒數次混勻，室溫沉淀10min。如果希望提取microRNA等小RNA，推薦-70℃沉淀過(guò)夜。c）于12,000g 4℃離心10min，在管底可見(jiàn)RNA沉淀，棄上清。

4.2    RNA的清洗：a）按每ml起初TRIzol Reagent加入1ml 75%乙醇重懸沉淀?！咀ⅲ篟NA在75%乙醇中-20℃至少保存1年，4℃至少1周】；b）低速漩渦或顛倒混勻，于7,500g 4℃離心5min，棄上清。再用離心機甩一下（>5,000rpm, 離心1秒），小心吸盡液體。c）操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5~10min）。不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥，否則會(huì )極大的降低其可溶性。部分溶解的RNA樣本的A260/A280比值＜1.6。

4.3    RNA的溶解：用20~50μl 無(wú)RNases水或含0.5% SDS的無(wú)RNases水溶解RNA，用槍上下吹打2~3次，使其充分溶解，置于-70℃保存或直接用于后續實(shí)驗，如果后續要做酶切反應請勿用SDS。

【注意】：對于肝臟、胰腺、腎臟等RNase含量較高的組織，沉淀可用100%去離子甲酰胺溶解。

5.      RNA產(chǎn)量的測定

5.1    用無(wú)RNase水稀釋RNA，之后測定在260nm和280nm的吸收值。

5.2    使用公式A260×稀釋倍數×40= μg RNA/ml。

5.3    計算A260/A280比值，比值在1.8~2.0之間視為純度較高，濃度＞4 μg/ml的樣品適用于分光光度計測定。

5.4    進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。