重組蛋白的保存方法和使用
無(wú)論是保存還是運輸,請避免反復凍融。反復凍融,冰晶會(huì )破壞重組蛋白的空間結構,導致蛋白變性形成多聚體和重組蛋白構象改變,從而加快了重組蛋白的降解速度。重組蛋白保存得當與否,直接決定了重組蛋白的活性使用效果。
一 溶解(凍干粉蛋白產(chǎn)品)
Step 1-離心:開(kāi)蓋前離心試劑管,可以選用快速離心10000-12000rpmx30s 或者3000-3500rpmx5min,效果良好。凍干粉在運輸過(guò)程中可能會(huì )因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上,所以在打開(kāi)塑料瓶蓋前,需將凍干粉通過(guò)離心收集到管底,以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。
Step 2-重懸:用推薦的稀釋液稀釋并重懸至0.1-1.0mg/ml,不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟,非常重要。需要用推薦的稀釋液重懸,并確保重懸液到指定的濃度范圍,不可以進(jìn)行渦旋振蕩。
Step 3-短期保存:該重懸液在2-8℃最長(cháng)可保存1周,用于短期實(shí)驗,方便實(shí)驗取用。
Step 4-長(cháng)期保存:如果實(shí)驗周期長(cháng)于一周,或配制的重組蛋白一次用不完,需對其進(jìn)行長(cháng)期保存。方法是:將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白,如0.1%BSA或者10%FBS或者5%HSA或者5%海藻糖的的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋?zhuān)缓蠓盅b凍存于-20℃至-80℃。
二 稀釋
可以用PBS或者細胞基礎培養基配制,0.1%BSA或者10%FBS或者5% HSA或者5%海藻糖的稀釋液備用(確保無(wú)菌)??梢允褂靡陨纤姆N稀釋液的任意一種稀釋重懸的蛋白溶液,稀釋濃度根據您的使用濃度確定,不要低于10ug/ml。即可分裝成小管,凍存在-20到-80度
三 蛋白產(chǎn)品的保存
幾種蛋白保存條件對比
保存需求 | 短期保存 | 長(cháng)期保存 | ||
保存條件 | 溶液保存于4℃ | 加入冷凍保護劑,儲存在-20℃ | 凍存在-80℃或液氮中 | 凍干粉 |
可保存試劑 | 1周-1個(gè)月 | 一年 | 幾年 | 幾年 |
需添加 | 蛋白酶抑制劑混合物,抗菌劑,蛋白穩定液 | 抗凍劑(甘油或者乙二醇),蛋白穩定液 | 無(wú) | 有的需要凍干保護劑 |
可使用次數 | 多次 | 多次 | 一次,反復凍融蛋白會(huì )降解,活力降低 | 一次,不可反復凍干 |
短期保存:
儲存在4°C溶液中
將濃縮蛋白質(zhì)儲存在單一溶液(如PBS),置于聚丙烯管或干凈的玻璃容器中,放在4°C冰箱保存。即提即用的蛋白溶液液非常適合如此保存。
優(yōu)點(diǎn):蛋白容易獲得,可以快速進(jìn)行實(shí)驗,且同一管樣品可重復取樣,這樣避免了因經(jīng)常解凍而加速蛋白的降解。
缺點(diǎn):在重復取樣時(shí),溫度升高且暴露于環(huán)境中,可能會(huì )導致微生物污染,蛋白質(zhì)失活和氧化。要避免這種情況,可以把蛋白質(zhì)分成小份儲存,并加入蛋白酶抑制劑、抗菌劑和還原劑等。但也要根據自己蛋白的情況,如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子內存在二硫鍵,為保證其完整性,應該存儲在氧化環(huán)境中。另外,儲存時(shí)間超過(guò)一個(gè)月的蛋白可以考慮扔掉。
長(cháng)期保存:
方案一:加入冷凍保護劑,儲存在-20°C可以將蛋白保存在含有25-50% (w) 甘油或乙二醇溶液中。
優(yōu)點(diǎn):在低溫下,蛋白質(zhì)對微生物污染,蛋白酶降解和氧化反應更有抵抗力,容易保證其活性。用甘油或乙二醇稀釋使蛋白處于溶液中,可以方便取樣。此外,這種方式儲存的蛋白質(zhì)可以保存長(cháng)達一年。
缺點(diǎn):蛋白質(zhì)在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化,也需加入抑制劑、還原劑等。而且將樣品存放在50%冷凍保護劑中有時(shí)是不可取的,取決于你接下來(lái)要做的實(shí)驗。
方案二:凍存在-80°C或液氮中將蛋白質(zhì)分裝成一次使用的量,快速冷凍。
優(yōu)點(diǎn):可以長(cháng)期保存(多年),不需要甘油、疊氮化鈉等化學(xué)物質(zhì),避免蛋白質(zhì)降解或微生物污染。
缺點(diǎn):冷凍蛋白質(zhì)應一次性使用,為了避免反復凍融發(fā)生降解。此外,抗體軛合物(特別是堿性磷酸酶復合物)冷凍后可能會(huì )失活。
方案三:凍干粉末將蛋白質(zhì)脫水凍干成粉末,在冰箱中無(wú)限期存放。
優(yōu)點(diǎn):蛋白質(zhì)不會(huì )像在水溶液中發(fā)生會(huì )水解和其他形式的化學(xué)降解,凍干蛋白質(zhì)的空間也比溶液要小,而且可以長(cháng)期儲存。
缺點(diǎn):凍干并不適用于所有蛋白質(zhì),與細胞膜相關(guān)的蛋白質(zhì)容易被凍干破壞。而且,并非所有的蛋白質(zhì)都凍干后都能保持穩定性,有的可能會(huì )變性,從而減少它們的有用性和再溶解的能力。此外,一些蛋白質(zhì)可能需要與蔗糖、甘露醇或BSA等才能保持穩定。
蛋白儲存的幾個(gè)技巧
分裝:無(wú)論是冷凍還是儲存在溶液中,將蛋白進(jìn)行分裝,以避免凍融,降低污染的風(fēng)險。
高濃度:一方面高濃度蛋白能更能減少與塑料或玻璃結合,另一方面高濃度有利于蛋白質(zhì)的穩定??梢詫⒌鞍诐饪s至1mg/ml以上,或選擇添加BSA等增加蛋白的濃度。
低溫:蛋白產(chǎn)品對溫度比較敏感。一方面在較低的溫度下,蛋白分子的熱運動(dòng)較低,分子內部成鍵不容易斷裂;另一方面溶液中可能存在的蛋白酶活性較低,微生物不容易生長(cháng)。
無(wú)菌:進(jìn)行蛋白實(shí)驗時(shí),一定要戴手套,為了防止細菌的生長(cháng),蛋白質(zhì)最好保存在滅菌的小管中。
速凍與速融:蛋白質(zhì)溶液保存中的冷凍過(guò)程,里面的純水首先會(huì )結為冰,這樣蛋白質(zhì)分子就會(huì )被暴露在高鹽濃度或者pH環(huán)境下,蛋白的活性可能會(huì )破壞。因此,盡可能縮短冷凍的過(guò)程和時(shí)間。速凍可以在液氮中進(jìn)行,也可以在干冰,乙醇和丙酮的混合物中進(jìn)行。速凍后,蛋白質(zhì)可以保存在-20度或-80度中。同樣的道理,蛋白質(zhì)融化的過(guò)程也要盡可能的快速,可以在溫水中進(jìn)行。
不可振蕩:震蕩產(chǎn)生的剪切力有可能會(huì )對蛋白質(zhì)產(chǎn)生破壞作用。震蕩時(shí)溶液中會(huì )產(chǎn)生氣泡,氧氣的進(jìn)入會(huì )導致蛋白質(zhì)處在氧化環(huán)境中。蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸,其極易被氧化為胱氨酸,這一過(guò)程很可能會(huì )破環(huán)蛋白質(zhì)的活性。這里所說(shuō)的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩(vortex)??梢杂脴岊^輕輕吹打幾次助溶,也可以輕輕用手翻轉瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上,這樣做來(lái)保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個(gè)內壁。
保護劑:添加乙二醇或甘油等保護劑,使蛋白穩定,防止結冰。抑制微生物的生長(cháng),添加硫柳汞01%(w / v)或疊氮化鈉0.05%(w / v)。阻止半胱氨酸氧化,可以加入1-5mM還原劑,例如DTT。
蛋白酶抑制劑:添加EDTA 、PMSF等蛋白酶抑制劑來(lái)減少蛋白質(zhì)降解。
蛋白中常見(jiàn)的添加試劑
蛋白酶抑制劑:有蛋白酶抑制劑混合物,能夠抵抗多種蛋白酶的剪切和破壞。以下為常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑
蛋白酶抑制劑 | 靶標蛋白酶 | 工作濃度 |
PMSF | 絲氨酸蛋白酶 | 0.1-1mM |
Benzamidine | 絲氨酸蛋白酶 | 1mM |
Pepstatin A | 酸性蛋白酶 | 1ug/ml |
Leupeptin | 1ug/ml | |
Aprotinin | 絲氨酸蛋白酶 | 5ug/ml |
Antipain | 1ug/ml | |
EDTA and EGTA | 金屬蛋白酶 | 0.1-1mM |
抗凍劑(例如乙二醇,甘油等):25%-50%濃度加入,防止結凍產(chǎn)生冰晶。
抗菌劑:0.02-0.05%的疊氮化鈉或者0.01 %的硫柳汞,抑制微生物。
蛋白穩定液:可用于蛋白冷藏或者冷凍保存,適用于酶類(lèi)或者需要維持完整功能的蛋白。
金屬離子螯合劑(EDTA)或者還原劑(DTT),維持半胱氨酸還原狀態(tài),防止被氧化。