亚洲 日韩 激情 无码 中出,亚洲欧美综合精品成人导航,国产精品三级AV及在线观看,色欲aⅴ亚洲情无码AV蜜桃,亚洲伊人成无码综合网

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗

欄目：技術(shù)支持
分享到：
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗
雙抗體夾心法（測抗原），間接法（測抗體）競爭法測抗原

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）雙抗體夾心法（測抗原）

實(shí)驗方法原理
圖1. 雙抗體夾心法測抗原示意圖
 
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
 
這種方法欲測的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類(lèi)的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。
實(shí)驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗步驟
一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。
 
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37℃作用1～2小時(shí)。
 
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時(shí)或由預試實(shí)驗確定作用時(shí)間。
 
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
七、加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
 
八、加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
九、觀(guān)察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492nm）OD值。
注意事項

1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。


2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì )競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學(xué)活性。


3.對某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當中存在著(zhù)許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。


4.用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現象?？赏ㄟ^(guò)棋盤(pán)滴定法進(jìn)行測定，但用單項滴定法更為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結合物進(jìn)行反應，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。


5.抗原包被固相載體除濃度外，對時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(cháng)包被時(shí)間。但為了方便起見(jiàn)，通常采用4℃包被過(guò)夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過(guò)夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿(mǎn)意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應通過(guò)滴定。

其他
一、ELISA的影響因素
 
1.  固相載體

可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。

由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規模應用。國產(chǎn)聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠(chǎng)出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿(mǎn)意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著(zhù)差別的。實(shí)驗證明，吸附效果似乎與塑料的類(lèi)型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。

因此，對每批制品在使用前，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2 ug/ml純化的正常人IgG進(jìn)行包被，經(jīng)洗滌后加酶標記抗人球蛋白進(jìn)行反應，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（OD值）。一般認為全板中每?jì)煽组gOD值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔OD值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的OD值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清OD值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前并不一定通過(guò)特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應用。
 
2.  抗原

在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來(lái)源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì )競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學(xué)活性。

經(jīng)試驗證明，適用于其他血清學(xué)試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過(guò)實(shí)踐，才能選出適用的優(yōu)質(zhì)抗原。對大多數傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時(shí)，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。

此外，對某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當中存在著(zhù)許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時(shí)也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時(shí)選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價(jià)抗體可能測不出來(lái)，或包被過(guò)量形成多層抗原吸附，故在操作過(guò)程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。

用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現象。那么用多大濃度抗原進(jìn)行包被最為合適呢？可通過(guò)棋盤(pán)滴定法進(jìn)行測定，但用單項滴定法更為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結合物進(jìn)行反應，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

抗原包被固相載體除濃度外，對時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(cháng)包被時(shí)間。但為了方便起見(jiàn)，通常采用4℃包被過(guò)夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過(guò)夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿(mǎn)意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應通過(guò)滴定。



酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）間接法（測抗體）

實(shí)驗方法原理

圖1：間接法測抗體示意圖

間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，(對人的標本來(lái)說(shuō)即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色，底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標記抗人IgM，則可用于早期診斷。

實(shí)驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗步驟
一、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反應板每個(gè)凹孔中,4℃過(guò)夜或37℃水浴2～3小時(shí)，貯存冰箱。
 
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
三、加被檢標本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0. 2ml，37℃，作用1～2小時(shí)。
 
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
五、加入酶結合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結合物0.2 ml 37℃作用1～2小時(shí)。
 
六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
七、加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
 
八、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
九、觀(guān)察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492nm）OD值。
 
注意事項

1.應注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會(huì )使大部分IgM和少量IgG喪失活性。


2.為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過(guò)量。


3.在孵育或洗滌過(guò)程中，已吸附的抗原可能有部份會(huì )從固相載體上被洗滌下來(lái)。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì )吸附到原來(lái)包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。


4.在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑可用來(lái)抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。


5.在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應，而且還可增加陽(yáng)性標本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無(wú)吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應用。

其他一、ELISA影響因素

1.  試驗樣品

血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會(huì )使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過(guò)程中抗體的穩定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清最好要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
 
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱(chēng)濕潤劑的緩沖液來(lái)稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來(lái)稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個(gè)稀釋度測定。對于作某一個(gè)傳染病的診斷來(lái)說(shuō)，最好先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個(gè)稀釋度（即測定劑量反應曲線(xiàn)），然后用一個(gè)稀釋測定即可。最適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來(lái)，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的(即含抗體)作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現在對有些標本（如流腦抗原）測定時(shí)，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時(shí)間。

2.  洗滌劑與稀釋劑

為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過(guò)量。但在孵育或洗滌過(guò)程中，已吸附的抗原可能有部份會(huì )從固相載體上被洗滌下來(lái)。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì )吸附到原來(lái)包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽(yáng)性反應,這是限制ELISA特異性的一個(gè)因素。因此不少學(xué)者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑來(lái)抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。已經(jīng)證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫-20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫-20為0.05%。（有人曾經(jīng)比較了四種洗滌劑，結果認為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP制備酶結合物時(shí)則不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結果觀(guān)察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利于加強封阻作用。最近有人報告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩沖液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
 
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應，而且還可增加陽(yáng)性標本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無(wú)吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。


酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）競爭法測抗原

實(shí)驗方法原理

圖1：競爭法測抗原示意圖


本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過(guò)程，稱(chēng)為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。
 
這種方法所測定的抗原只要有一個(gè)結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類(lèi)的測定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因為只有一個(gè)保溫洗滌過(guò)程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點(diǎn)。
實(shí)驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗步驟
一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。
 
二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
三、分2組，a組加酶標記抗原和被檢抗原混合液0.2 ml，b組只加酶標記抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小時(shí)。（混合液可作成不同稀釋度）
 
四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
五、加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
 
六、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
七、用酶標比色計測定a、b兩組OD值，并求出a、b、OD值的差數。
其他
一、影響ELISA的因素

1.  試驗的重復性（精確度）

有二種方法來(lái)檢驗試驗的精確度：通常用變異系數來(lái)表示：1、幾個(gè)樣品用ELISA法同時(shí)進(jìn)行多次測定求出CV%；2、不同時(shí)間對不同操作者對某幾個(gè)樣進(jìn)行多次測定求出變異系數。CV是個(gè)體參數標準差與平均數的比率。
 
S / X ＝ CV ，CV應低10%，不應大于10～15%。
 
不論目測或分光光度計測定，均可作一個(gè)稀釋度或一系列稀釋度測定，一般常規診斷只用一個(gè)稀釋度判斷陽(yáng)性或陰性就可以了，這樣比較方便，現在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個(gè)稀釋度。有些需要精確定量的，可作一系列稀釋度測定。
 
記錄結果有下列幾種方法：
 
1、“+”或“-”：所有超過(guò)規定的OD值（如OD，0.4）的標本均屬陽(yáng)性，此規定OD值是根據事先測定大量陰性標本所取得的，此規定值是陰性標本的上限?；蛘咭砸唤M陰性標本OD平均值加2～3個(gè)標準差作為陽(yáng)性閾值。
 
2、直接以OD值來(lái)表示，如0.4、0.7、1.2，OD值越大，陽(yáng)性反應越強，但此數值是在固定實(shí)驗條件下得到的結果，而且每次實(shí)驗都要有參考標本作對照。
 
3、以終點(diǎn)滴度表示：將標本作連續稀釋?zhuān)罡呦♂尪饶艹霈F陽(yáng)性反應者（即OD值仍大于陽(yáng)性閾值，即為該標本的滴度。
 
4、以“比值表示：求出被檢標本的OD值與一組陰性標本OD值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽(yáng)性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，<1.5為陰性。
 
測定標本OD值-空白OD值
 
 
陰性對照OD值-空白OD值
 
如在此測定時(shí)以空白校正“O”點(diǎn)。
 
5、以“單位”來(lái)表示：在測定被檢標本的同時(shí)，再測定一個(gè)含已知單位數的陽(yáng)性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測后，以OD值為縱坐標，單位數為橫坐標，畫(huà)出標準曲線(xiàn)。以后可根據被檢標本的OD值，從曲線(xiàn)上找出相應的單位數，再乘于血清的稀釋倍數，即可得出被檢標本的單位數。
 
作試驗時(shí)的陰性參考血清最好不要顯色，否則會(huì )對結果判斷帶來(lái)困難，特別在目測時(shí)，當陽(yáng)性標本OD值>2.0時(shí)，應作適當稀釋后再作測定。
 
2.  對使用儀器要求

所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結合和底物的吸管和容器一定要分開(kāi)。試劑要求標準化。