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干貨 | WB 實(shí)驗中的關(guān)鍵控制點(diǎn)和注意事項

欄目：技術(shù)支持
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滿(mǎn)懷期待跑 WB，拍照后卻發(fā)愁了，條帶怎么這么弱？這種時(shí)候，相信很多小伙伴都百思不得其解，除了發(fā)問(wèn)“條帶去哪了”，還一度相信 WB 就是門(mén)玄學(xué)。長(cháng)此以往，大家面對 WB 實(shí)驗似乎都抱有“心誠則靈”的無(wú)力態(tài)度，萬(wàn)一成功了呢？

玩笑歸玩笑，言歸正傳，面對不好拿下的 WB 實(shí)驗，“心誠則靈”是有道理的?！靶恼\”的意思是，面對失敗的實(shí)驗我們有必要用心逐一排查問(wèn)題所在，優(yōu)化實(shí)驗體系?？偠灾诜爆崗碗s的 WB 面前，沒(méi)有任何捷徑。

本期的干貨課堂我們就來(lái)重點(diǎn)探討 WB 實(shí)驗中的一些關(guān)鍵控制點(diǎn)，并提供實(shí)用的 Tips 供大家參考。

WB 實(shí)驗步驟


WB 實(shí)驗中的關(guān)鍵控制點(diǎn)和注意事項

Key Points about WB


一

WB 樣本的制備


1

將樣品置于冰上或者維持在 4℃ 下


2

選擇合適的抑制劑


抑制劑推薦


蛋白酶抑制劑

在細胞破裂蛋白抽提的過(guò)程中，這些蛋白酶也會(huì )被一起釋放出來(lái)，混入蛋白樣品中，對蛋白樣品造成降解



磷酸酶抑制劑

*（檢測磷酸化條帶時(shí)必須要添加）

磷酸酶機理：通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基

二

選擇合適的蛋白定量方法


1

進(jìn)行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析


2

通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作為蛋白質(zhì)標準品

三

WB 電泳分離


1

用還原及變性的緩沖液 (e.g. Laemmli buffer)將蛋白變性，準備上樣

使多肽帶上負電荷

使蛋白變性并將多肽拉直

將二硫鍵打斷

使抗原表位暴露出來(lái)


2

凝膠上樣

20-40 μg 全細胞裂解液或 100 ng 純化蛋白

每條泳道上相同蛋白量

根據目標蛋白的表達量?jì)?yōu)化上樣量


3

分離膠選擇 Tips（FuturePAGE蛋白預制膠）

分子量 4-40 kDa，分離膠濃度 20％

分子量 12-45 kDa，分離膠濃度 15％

分子量 10-70 kDa，分離膠濃度 12.5％

分子量 15-100 kDa，分離膠濃度 10％

分子量 25-200 kDa，分離膠濃度 8％

四

WB 的蛋白轉膜

電泳結束后，凝膠(帶有已分離的蛋白)與膜緊貼放置，使用電流把蛋白從凝膠轉到膜上。轉膜結束后可用麗春紅進(jìn)行可逆轉色判斷轉移效果。

1

膜的類(lèi)型

硝酸纖維素膜（NC 膜），韌性差，低背景

Polyvinylidene Difluoride (PVDF 膜轉印包)，甲醇激活，蛋白結合力強

2

轉膜 Tips

對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉膜緩沖液中加入 SDS 至終濃度為 0.1％；對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉膜緩沖液中使用 10％ 或者更低濃度的甲醇；對于分子量較小的靶蛋白，推薦在轉膜緩沖液中使用 20％ 甲醇

對于分子量較大的靶標蛋白，建議使用 0.45 μm 的 PVDF 膜；對于分子量較小的靶標蛋白，建議使用 0.22 μm 的 PVDF 膜


五

WB 的封閉處理


膜封閉處理可降低一抗/二抗的非特異性結合。



常用的封閉劑


5% 脫脂奶粉 in TBST

5% BSA in TBST

六

抗體孵育


1

一抗特異性地檢測目標蛋白

一抗室溫孵育 1-2 h 或 4 ℃ 過(guò)夜孵育

選用適合的一抗工作濃度或稀釋度

一抗可以用封閉液來(lái)稀釋

WB 信

2

二抗辨認一抗的恒定區

（具有物種特異性）


二抗室溫孵育 1-2 h

選用適合的二抗工作濃度或稀釋度，一般工作濃度要低于一抗

二抗可以用封閉液來(lái)稀釋

二抗帶有標簽


七

WB 的信號檢測



檢測方法分為化學(xué)發(fā)光檢測和熒光檢測。


號檢