陰性對照出現陽(yáng)性結果

試劑/樣品污染

試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器。

夾心ELISA - 檢測抗體與包被抗體反應

確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體,他們之間不會(huì )互相反應。

酶標板洗板不徹底

用洗液充滿(mǎn)板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈。

抗體量過(guò)多導致非特異結合

根據推薦用量使用抗體。盡量使用較少的抗體。

酶標板整體背景高

結合反應太強或時(shí)間過(guò)長(cháng)

檢查底物的稀釋?zhuān)褂媒ㄗh的稀釋度。當酶標板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取時(shí)立即用終止液終止反應。

底物溶液或終止液不是新配制

使用新配制的底物溶液。終止液應該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標志，需要重新配制）。

沒(méi)有終止反應

如果底物反應沒(méi)有被終止，顏色會(huì )繼續變化。

酶標板在酶標儀讀板前放置時(shí)間過(guò)長(cháng)

顏色會(huì )繼續變化（盡管加了終止液，依然會(huì )以很慢的速度變化)。

試驗器皿污染

確保試劑是新配的并且使用的是清潔的玻璃器

底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光

底物孵育應該在避光條件下進(jìn)行。

孵育溫度過(guò)高

抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。

抗體非特異性結合

確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當的封閉液。我們建議使用 5-10% 的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清。

確保板孔經(jīng)過(guò)預處理以防止非特異結合。使用親和力強、純度高的抗體，最好經(jīng)過(guò)了預吸收。

請檢查針對“陰性對照出現陽(yáng)性結果”的建議

吸光度數值低

使用的樣品中沒(méi)有顯示出靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低

檢查靶蛋白表達系統，確保它在您的樣品中被表達出來(lái)。如果靶蛋白的表達水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇

一個(gè)更靈敏 的測定方法。確保您使用的是沒(méi)有超出測定方法檢測范圍的陽(yáng)性對照。

抗體不足

確定使用的是建議的抗體量，為了使結果更好可能需要增加抗體的濃度。

底物溶液不是新鮮配制或成分有誤

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

試劑不是新鮮配制或pH值有誤

確保試劑配制正確并在有效期內。

孵育時(shí)間不夠長(cháng)

如果建議了孵育時(shí)間，確保按推薦的時(shí)間長(cháng)度孵育抗體。為了使結果更理想，孵育時(shí)間可能需要增加。

孵育溫度太低

抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性，確保孵育是在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫。

未加終止液

加入終止液可以增加顯色反應的強度，也能固定反應最終的顏色。

吸光度數值高

樣品和/或陽(yáng)性對照吸光度數值高。吸光度沒(méi)有按樣品在板子上的稀釋度遞減。

樣品或陽(yáng)性對照的濃度過(guò)高，超出了試驗方法檢測的范圍。重新設置試驗方法或者在加樣前通過(guò)稀釋降低樣品和對照的濃度，在處理結果計 算濃度時(shí)考慮到所作的稀釋。

酶標板上吸光度不規律

孵育時(shí)酶標板疊在一起酶標板疊在一起使板子每個(gè)孔的溫度不能平衡一致，請避免堆疊。

吸液不一致

確保移液器使用正確并經(jīng)過(guò)校準、確保槍頭插得足夠緊密。板子稀釋時(shí)要特別仔細，注意確保每個(gè)槍頭都吸上和排出正確量的液體，這對平 行樣品結果的一致性有很大影響。

抗體稀釋液/試劑未混勻

為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被混合均勻。

板孔變干涸

確保所有孵育期間酶標板始終被蓋好。放置一個(gè)潮濕的水盤(pán)(保持清潔，無(wú)菌水)在孵育箱的底部。

洗板不充分

這將導致一些孔沒(méi)有其他孔清洗的好，殘留不同量的未結合的抗體，使后面的結果產(chǎn)生不一致。

酶標板底部不凈影響吸光度讀取

讀板前小心清潔酶標板底部。

顏色變化過(guò)慢

酶標板未處于恰當的溫度中確保酶標板處于室溫，試劑在使用前也處于室溫。

結合能力太弱

使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存，使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

溶液污染

例如象疊氮化鈉和過(guò)氧化物酶這類(lèi)污染物的存在，將會(huì )影響底物的反應，避免使用含有這些防腐劑的試劑。