細胞培養過(guò)程中如果操作不當或者條件控制不合適見(jiàn)容易受到化學(xué)或者生物因素的污染，常見(jiàn)的污染源有：　

1、細菌污染

　　細菌污染是實(shí)驗室細胞培養中常見(jiàn)的污染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。

　　培養細胞受細菌污染后，會(huì )出現培養液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

2、真菌污染

　　真菌污染是細胞培養過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

　　培養細胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養液中漂浮著(zhù)白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(cháng)，培養液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。

　　真菌污染后，細胞生長(cháng)變慢，但最后由于營(yíng)養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

3、支原體污染

　　支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開(kāi)始不易發(fā)現，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。

　　培養細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見(jiàn)細胞生長(cháng)增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì )產(chǎn)生交叉污染。

4、病毒污染

　　組織細胞培養過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì )產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發(fā)現不少于20種血清性病毒。

盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

5、非同種細胞污染

　　由于細胞培養操作時(shí)各細胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴格分開(kāi)，往往會(huì )使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實(shí)驗宣告無(wú)效。

   在發(fā)現培養的細胞出現生長(cháng)異常時(shí)需要對細胞的污染情況進(jìn)行鑒別，以利于采取補救措施。常見(jiàn)的污染鑒別方法如下：

　　1、細菌、真菌污染的檢測

　?。?）肉眼觀(guān)察

　　細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內可明顯觀(guān)察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　?。?）接種觀(guān)察

　　采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發(fā)現是否有污染。

　?。?）鏡下觀(guān)察

　　在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。

　　若細胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

　　2、支原體污染的檢測

　?。?）相差顯微鏡觀(guān)察

　　直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀(guān)察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類(lèi)似于布朗運動(dòng)的表現。

　　應注意與細胞破碎溢出的內容物如線(xiàn)粒體等相區別。

　?。?）熒光染色法觀(guān)察

　　用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著(zhù)色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細胞周?chē)蚋接诩毎砻妗?/span>

　　 （3）電鏡檢測

　　若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀(guān)察。一般在細胞培養48～72小時(shí)，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀(guān)察。

　?。?）培養檢測

　　將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天后觀(guān)察肉湯培養有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀(guān)察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病

　　冠狀病毒電鏡圖：

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒